Determinando la Secuencia

Instituto tecnológico de Mérida[pic 1]

Bioquímica

Ingeniería ambiental

Unidad 1

Nombre del alumno: José Roberto cruz Balam

Nombre del maestro: Alicia cardos

Determinando la Secuencia

Paso 1: Separación de cadenas

•la Separación es llevada a cabo con: pH extremo ,8M urea ,6M guanidina HCl o concentración alta de sales (Generalmente sulfato de amonio)

Paso 2: Corte de Puentes Disulfuro

El corte es realizado por los agentes reductores Sulfhidrílicos que pueden ser mercaptoetanol , ditiotreitol o ditioeritritol . Para prevenir recombinación, seguir con agente alquilante

Paso 3: Determinar composición de aminoácidos

1. Hidrólisis química de todos los enlaces peptídicos con HCl 6N, 110 ºC x 24 h

2. Cromatografía de intercambio iónico

3. Aminoácidos + compuesto fluorescente/coloreado es eluido de columna de intercambio iónico

4. Intensidad de señal es proporcional a concentración del aminoácido

Paso 4: Identificar residuos N- y C-terminal

• Analisis N-terminal  se utiliza el  Método de Sanger: utiliza 1-fluoro-2,4 dinitrobenzeno (FDNB) que marca 1er aa. E hidroliza el resto del polipéptido o puede ser utilizado el Método de Edman = Fenilisotiocianato derivados son Feniltiohidantoínas (o derivados PTH) Se marca extremo N-terminal, se hidroliza este residuo y se repite Degradación de Edman

Paso 4: Identificar residuos N- y C-terminal

• Análisis C-terminal se utiliza  un análisis enzimático (carboxipeptidasa) realizada con Carboxipeptidasa A corta cualquier residuo en extremo carboxilo excepto Pro, Arg, y Lys o con Carboxipeptidasa B (pancreas de cerdo) sólo actúa en Arg y Lys del extremo C-terminal

Pasos 5 y 6: Fragmentación de las cadenas

Fragmentación Enzimática con tripsina, quimiotripsina, clostripaina o proteasa de Staphylococcuso con  Fragmentación Química con Bromuro de cianógeno

Paso 7: Reconstruyendo la Secuencia

Para la reconstrucción  de la secuencia hay que usar dos o más agentes fragmentadores en experimentos separados por consiguiente  Secuenciar todos los péptidos producidos (generalmente por degradación de Edman) .Comparar y alinear péptidos con secuencias que se sobrepongan para determinar la secuencia de la cadena polipeptídica original Reconstruyendo la Secuencia Comparar corte por tripsina y proteasa de Staphylococco en un péptido típico :

• Corte por Tripsina :  A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K

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