EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIRRADICALARIA POR EL MÉTODO DEL DPPH

Universidad de Los Andes[pic 1]

Núcleo Universitario Rafael Rangel

Departamento de Biología y Química

Grupo de Investigación de productos naturales (GIPRONA)

Lab. Productos Naturales “Dr. Alfredo Nicolás Usubillaga del hierro”

UNIDAD CURRICULAR DE análisis farmacéutico ii

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIRRADICALARIA POR EL MÉTODO DEL DPPH

Prof. Libia Alarcón

Prof. Alexis Peña

Trujillo, 2017.

ABREVIATURAS Y NOMENCLATURA

µL= Microlitro

M= Molar

°C =Grados Celsius

g =Gramo

Kg =Kilogramo

L= Litro

mg =Miligramo

min =Minuto

mL =mililitro

R= Radical

µg=Microgramo

UV=Ultravioleta

ABTS =ácido 2, 2’ Azinobis-3-etil- benzotiazolin-6 sulfónico

CF =Compuestos fenólicos

F-C =Folin & Ciocalteau (ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico)

FL =Flavonoides

FRAP =Ferric reducing antioxidant power (Poder antioxidante de reducción férrica)

EAG= Equivalente de ácido gálico

TROLOX =Ácido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilcroman-2-carboxílico

ET =Equivalentes de Trolox

NADPH = Nicotin-adenosin di phosfato hidro nucleótido

ERONS= Especies reactivas de nitrógeno

EROS =Especies reactivas de oxigeno

ORAC= Oxygen radical absorbance capacity

DPPH= 2,2-difenil-1-picril-hidrazil

SOD=Superóxido dismutasa 

GSH = glutatión

GPx= Glutatión peroxidasa 

1. INTRODUCCIÓN

Los adelantos científicos, específicamente en la medicina son realmente sorprendentes tanto en el conocimiento de las enfermedades y su tratamiento, como de sus complicaciones, no obstante quedan aún muchas dudas que aclarar con respecto al origen de estas. En los últimos 30 años viene desarrollándose cada día un interés mayor por los problemas relacionados con el estrés oxidativo, los radicales libres, las especies reactivas del oxígeno y los antioxidantes, debido a la importancia que poseen en la bioquímica, la biología y la medicina (Venereo, 2002). 

En la vida diaria nos vemos bombardeados por el término antioxidante, esta propiedad es atribuida a alimentos, bebidas, cosméticos, e incluso a complementos nutricionales. Son cientos los productos a los cuales se les atribuye esa capacidad de evitar la oxidación de nuestro organismo, por lo que resulta fácil aceptar ese término y se asume, sin ningún problema, que evitar que el cuerpo se oxide es algo esencial, para sentirnos sanos. En los últimos tiempos se ha popularizado la capacidad antioxidante de sustancias cómo el té (epigalocatequinas), el aceite de oliva, las frutas ricas en vitaminas C y E, el vino tinto (Polifenoles), la miel y la gran cantidad de productos que se venden enriquecidos con los principios activos de estos, desde cremas antienvegecimiento hasta yogures. Pero realmente ¿cuál es la función de este tipo de sustancias? Esto tiene una sencilla explicación para la cual debemos remontarnos, al origen de la vida (http://www.hifasdaterra.com/web/oxidacion-y-antioxidantes/ ).

La vida surgió sin oxígeno. La síntesis de proteínas, así como material genético y en definitiva de las moléculas sobre las que se basa el origen de la vida fue posible en una atmósfera carente de oxígeno. Las células que componen los organismo tal y como los conocemos es la consecuencia de un ambiente reductor (no oxidante). La atmósfera oxidante es posterior al nacimiento de la vida. Sin embargo, las células respiran, poseen su pulmón particular, que es la mitocondria, en ella tiene lugar el proceso de respiración celular. La respiración aeróbica requiere la presencia de oxígeno para generar energía, pero este proceso genera residuos, los cuales se conocen comúnmente como las Especies Reactivas del Oxígeno (EROs), dentro de las cuales se destacan los conocidos comúnmente como radicales libres (http://www.hifasdaterra.com/web/oxidacion-y-antioxidantes/ ).

Los radicales libres son moléculas altamente inestables y por lo tanto reactivas. La finalidad de estos radicales libres es encontrar su propia estabilidad. Para ello necesitan oxidar algo, oxidan todas las moléculas que encuentran a su paso, lo cual los convierte en compuestos totalmente indeseables. Oxidan desde los azúcares y proteínas hasta el material genético, sin embargo no se puede olvidar que estos compuestos que tanto daño hacen al organismo son el resultado de los procesos a partir de los cuales obtenemos la energía. Estos procesos son irremplazables, son la vida propiamente dicha. La generación de la energía que le permite a los seres vivos, sentir, interactuar, correr, pensar y en definitiva vivir, es lo que lentamente va dañando y perjudicando de una manera irreversible al organismo, alcanzando una oxidación total denominada muerte. Los antioxidantes, ayudan a retrasar estos daños al evitar la pérdida de vitalidad, y a disminuir la vulnerabilidad del cuerpo al paso de los años (http://www.hifasdaterra.com/web/oxidacion-y-antioxidantes/ ).

Los efectos producidos por las oxidaciones en el interior del organismo, son muy variados, desde anemias hemolíticas, al afectar a los ácidos grasos que componen las membranas celulares y por lo tanto imprescindibles para su integridad, hasta pérdida de memoria o de las funciones cognitivas, al verse dañadas proteínas neuronales. De todas las modificaciones descritas son probablemente las alteraciones acumulativas en el ADN las principales responsables del deterioro celular por acción de los radicales libres, ya que estas alteraciones producen mutaciones genéticas pudiendo concluir en un cáncer (Wiseman & Halliwell, 1996). Existen varios trabajos en los cuales se expone la relación existente entre el estrés oxidativo y algunas enfermedades, como la displasia mamaria (Ahn et al., 2004), cáncer de estomago (Halliwell, 1996), enfermedades coronarias (Pham-Huy et al., 2008; Misra et al., 2009) y diabetes (Maritim, Sanders, Watkins, 2003).

El organismo es sabio, sabe que la respiración aeróbica produce deshechos (radicales libres) que atacan las estructuras presentes en  la propia célula y por ello posee una potente línea defensiva, con procesos antioxidantes propios, mecanismos encargados de la eliminación de radicales libres, como es el caso de la Superóxido Dismutasa (SOD) o el glutatión (GSH) entre otros. Numerosos derivados vitamínicos colaboran en este proceso protector, así las vitaminas E  y C  actúan eliminando radicales libres de los tejidos al igual que los polifenoles presentes en el chocolate o el vino tinto, como es el caso del resveratrol (figura 4 d) del vino o las epigalocatequinas del té, los cuales ejercen una importante acción protectora secuestrando los radicales libres (Gould & Lister, 2006).

En el presente estudio se realizó una revisión sobre el tema de los radicales libres del oxígeno, las especies reactivas del oxígeno y el estrés oxidativo, así como también sobre los artículos más relevantes desde el año 2000 hasta la actualidad a través del buscador scirus de la red de la Universidad de Los Andes (SERBIULA), science direct y google académico, relacionados con la capacidad antioxidante de compuestos fenólicos. Con el objetivo de acercar a los diferentes lectores al interesante y cada vez más importante mundo de los radicales libres, tema que en la actualidad es de gran interés para bioquímicos, fisiólogos y otros especialistas de las ciencias básicas y de la medicina (Halliwell, 1996). En la presente revisión se presenta una visión general de los principales aspectos del tema, se mencionan conceptos, clasificaciones y características de los radicales libres y de los diferentes sistemas de defensa antioxidante; se explican brevemente los mecanismos por los cuales se producen los daños de estas especies químicas sobre el organismo, así como un  análisis, sobre el estado actual de los compuestos fenólicos como agentes antioxidantes y la paradoja que se genera alrededor de ellos cuando estudios recientes revelan que pueden actuar también  como agentes prooxidantes en blancos celulares específicos.

Palabras claves: radicales libres/análisis; radicales libres/efectos adversos; estrés oxidativo; antioxidantes, compuestos fenólicos.

2. MARCO TEORICO

    2.1 ESTRÉS OXIDATIVO EN LA SALUD HUMANA

A partir de la introducción del oxígeno molecular en nuestra atmósfera por los organismos fotosintéticos, hace aproximadamente 2,5 billones de años, las especies reactivas de oxígeno (EROs) han sido los productos indeseables del metabolismo aerobio (Wickens, 2001). De manera habitual, el oxígeno se encuentra en su forma más estable (O2), con los electrones que forman el enlace pi antienlazante con el mismo espín. Es decir en lo que se conoce como estado triplete, así el oxígeno es poco reactivo con una velocidad de reacción baja a la temperatura fisiológica (Halliwell, 1999). Sin embargo por reacciones químicas, por acciones enzimáticas o por efecto de las radiaciones ionizantes, se pueden producir una serie de especies químicas o sustancias prooxidantes (moléculas o radicales libres altamente reactivos) que son capaces de dar lugar a múltiples reacciones con otros compuestos presentes en el organismo, que llegan a producir daño celular. El problema para el organismo humano se produce cuando tiene que tolerar de forma continúa un exceso de radicales libres, los cuales aparte de ser producidos por el metabolismo normal son generados por varios factores que actúan dentro o penetran en el organismo. Las tensiones sociales, las presiones políticas y emocionales, la contaminación ambiental, la contaminación industrial y acústica, el humo del tabaco, los herbicidas, pesticidas, el consumo de ciertas grasas, entre otros, son algunos de los factores que incrementan excesivamente la generación de radicales libres. Este exceso supera la resistencia o capacidad de respuesta homeostática del orgánismo, por lo que no pueden ser eliminados (Flores, 2000).

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