Efecto Del PH Y Temperatura Sobre La Actividad De Tripsina

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN DE TRIPSINA

INTRODUCCION

Al analizar como transcurre la reacción catalizada por una enzima con respecto al tiempo observamos que la velocidad de reacción disminuye. Mientras el tiempo aumenta la velocidad disminuye por factores tales como que el producto puede inhibir la reacción, que el grado de saturación disminuye por que el sustrato se está agotando, y/o que la enzima puede inactivarse por que el pH o temperatura del medio que pueden estar cambiando. Por esa razón utilizar la velocidad inicial (Vo). Medida velocidad inicial significa medir la reacción de un período corto de tiempo de manera que se pueda asumir que los factores que pueden alterar la velocidad de reacción no cambian. En estas condiciones se pueden determinar el efecto que produce sobre la velocidad inicial la variación de un solo factor, manteniendo al resto constante.

Si se evaluá el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial, se observa qué medida que se incrementa la concentración de sustrato la velocidad aumenta hasta un Valor máximo. En ese momento se dice que la enzima está saturada con el sustrato. Se transformó una cantidad constante de sustrato por unidad de tiempo, y que es la máxima posible. Aun cuando se incrementa la concentración de sustrato, la velocidad inicial permanecer constante, se habrá alcanzado entonces la velocidad máxima (Vmax). Cuando la concentración de sustrato es pequeña, la velocidad inicial está en función a la cantidad de sustrato.

Al evaluar el efecto que la concentración de sustrato se observa un comportamiento hiperbólico, que puede ser descrito mediante la ecuación de Michaellis-Menten:

Vo= Vmax[S]/(Km+[S] )

Donde:

Vo, representa la velocidad incial que alcanza la enzima para la concentración de sustrato representada por [S].

Vmax, representa la velocidad máxima de reacción alcanzada por una enzima en particular, en términos de velocidad inicial.

Km, representa la concentración de sustrato a la cual la enzima trabaja a la mitad de la velocidad máxima. El Km es un valor constante para la enzima.

Sin embargo en condiciones prácticas la representación de las inversas de las concentraciones de sustrato y las inversas de los valores de velocidad nos permite hacer determinaciones exactas de los valores de Vmax y Km para una enzima (ecuación de Lineweaver-Burk).

MARCO TEÓRICO

El conjunto de las enzimas proteolíticas está constituido de dos grupos: las endopeptidasas, que cortan enlaces peptídicos en el interior de las cadenas proteícas y las exopeptidasas, quecortan los enlaces peptidicos aminoterminales, carboxiterminales y los dipeptidos. (Cruz, et al 1996).

La tripsina, endoproteasa de la familia de las serin-proteasas, se caracteriza por un mecanismo catalítico común, implicando tres residuos aminoacidicos (histidina, ácidoaspártico y serina) hidrolizando el enlace peptídico del lado carboxilico de la arginina o de la lisina. (Wormhoudt, et al 1999). Para evaluar la velocidad de tripsina, se utiliza el hidrocloruro de N-alfa-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BApNA), un sustrato sintético (Gamboa, 2001).

Este sustrato sintético, posee características proteicas y posee una especificidad de reconocimiento por parte de la Tripsina muy elevada, lo que permite un correcto análisis de las propiedades cinéticas de está enzima. El mecanismo de acción de BApNA es su analogía con el sustrato verdadero a nivel de las estructuras peptidicas, su extremo amino es bloqueado por el grupo radical Benzoil y en su extremo carboxilo se une a un grupo cromógeno, que en la práctica es la p - nitroanilida la cual es hidrolizada a nivel de su enlace en el BApNA debido a la acción de la tripsina, la p - nitroanilida será llevada a medición en el espectofotométro a una longitud de onda de 410nm (Battaner, 2000)

Debe trabajarse con soluciones amortiguadoras que contengan CaCl2, lo que promueve una actividad y estabilidad óptima de la enzima, debido a que esta es sensible a procesos de autolisis si no se manejan las variables adecuadas en su incubación ya que los sitios amino y carboxilo terminales son flexibles de acuerdo a la estructura terciaria de la enzima y a condiciones no fisiologicas (Félix et al., 2005).

La catálisis enzimatica de las reacciones es esencial para los sistemas vivos , pues en condiciones biológicas las reacciones no catalizadas por una enzima suelen ser muy lentas. La función de una enzima es acelerar la velocidad de la reacción de un sustrato específico . La velocidad de una reacción enzimatica viene determinada por la concentración de reactivo y por una constante de velocidad, donde tambien depende de constantes como el pH, Temperatura, concentración de enzima, presencia de inhibidores o cofactores, etc., lo cual se deriva en una tasa de cambio en la formación de producto por unidad de tiempo (Lehninger, 2009). La actividad enzimatica se expresa en micromoles de producto por minuto de reaccion (µmP/min), lo cual es el patrón estandar de la medicion de unidades enzimaticas (UE).

Para la práctica, las constantes mencionadas anteriormente deben mantenerse a condiciones constantes, salvo la concentración de sustrato que es la variable utilizada para el estudio de la actividad enzimatica de tripsina en las diferentes muestras incubadas. Por lo tanto, a concentraciones bajas de sustrato y según la relación establecida por Michaelis - Menten, la velocidad de reacción será directamente proporcional a la concentración de sustrato siempre y cuando la cinética corresponda al primer orden, donde [S] <0.01Km; luego mientras la concentración de sustrato va aumentando, la velocidad de reacción sigue un patrón diferente al de la cinética de primer orden, donde no es posible establecer concluciones; finalmente el analisis concluye hasta alcanzar una velocidad de reacción constante y máxima que determina una cinética de orden cero, donde [S] > 100Km lo cual indica la saturación de la enzima con el sustrato correspondiente.

CALCULOS Y RESULTADOS

A continuación el cuadro de resultados:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

A_M 0.245 0.305 0.362 0.423 0.474 0.577 0.578

A_R 0.254 0.314 0.359 0.422 0.475 0.508 0.544

A_blanco 0.012 0.018 0.02 0.031 0.038 0.044 0.06

Cálculo de la concentración de sustrato (BAPNA, PM = 434.88)

40 mg BAPNA -------------------------------100 ml

0.04 g BAPNA ------------------------------ 100 ml

(0.04 g)⁄((434.88 g/mol)) BAPNA ---------- 100 ml

9.198 x 〖10〗^(-5) mol BAPNA --------------- 100 ml

x ----------------------------------------------- 1000 ml

x=9.198 x

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