El principio de la técnica se basa en la PCR

Introduccion

PCR en tiempo real: fundamentos : Los primeros que sentaron las bases para desarrollar la PCR en tiempo real fueron Higuchi y colaboradores, en 1992, al video grabar en tiempo real la incorporación de bromuro de etidio al ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV.7 objetivo de la PCR en tiempo real ha sido detectar y cuantifi car las secuencias específi cas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fl uorescentes en la reacción.

El principio de la técnica se basa en la PCR punto fi nal, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la amplifi cación es diferente. El término en tiempo real se refi ere a que la detección de los productos amplifi cados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantifi car la cantidad de ADN en la muestra, a diferencia de la PCR punto fi nal en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantifi car la secuencia blanco. Precisamente, estas últimas dos características representan grandes ventajas de la PCR en tiempo real, ya que el producto de amplifi cación es monitoreado conforme transcurre la reacción8 sin que haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa para conocer si la reacción fue exitosa como sucede en la PCR punto fi nal.

Actualmente, la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y cuantifi car los ácidos nucleicos. Aun teniendo una cantidad muy pequeña de templado, el sistema garantiza una alta sensibilidad, especifi cidad y efi ciencia. Una de sus aplicaciones más usadas es para cuantifi car cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles del ARNm procedente de células o tejidos. La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a partir de concentraciones bajas a diferencia de la PCR, punto fi nal que necesita una mayor concentración.

El monitoreo de los productos amplifi cados conforme transcurre la reacción es un paso importante en la PCR en tiempo real, para ello la estrategia tecnológica que ha dado buenos resultados es los sistema basados en reporteros fl uorescentes. En general, estos sistemas pueden ser clasifi cados en dos métodos diferentes: específi cos y no específi cos

Los métodos específi cos parten de principios distintos a diferencia de los no específi cos y tienen en común la señal de fl uorescencia emitida para detectar los productos amplifi cados. Estos métodos siguen el principio conocido como «transferencia de energía de resonancia fl uorescente» (FRET, por sus siglas en inglés) para generar la señal; este método consiste en transferir energía desde un donador o reportero fl uorescente a un aceptor o «quencher». Para ello, existen dos métodos específi cos, éstos son: pruebas basadas en hidrólisis y por hibridación.

Los métodos específi cos son más costosos que los no específi cos, pero son más efi cientes al garantizar la especifi cidad de la reacción, evitando la formación de productos inespecífi cos.

Cualquiera que sea el método que se aplique, se pueden adquirir fácilmente, ya que la gama de sondas para desarrollar, tanto los métodos específi cos como los no específi cos, es amplia.

Para la cuantificación, se mide en cada ciclo de PCR la cantidad de amplicón producido. La cuantificación del producto se produce mediante la adición de fluoróforos que se unen al amplicón de forma cuantitativa, de forma que a mayor producto mayor fluorescencia se emitirá. Los sistemas de PCR a tiempo real detectan la cantidad de fluorescencia producida en cada ciclo de PCR y los softwares de análisis representan dicha fluorescencia gráficamente respecto al número de ciclos. La cantidad de amplicón producido es proporcional al número de moléculas de RNA/DNA iniciales, de forma que en aquellas muestras con mayor expresión del gen el amplicón fluorescente aparecerá en ciclos anteriores.

Tipos de fluorocromos Se utilizan principalmente dos tipos de fluorocromos. Un método muy utilizado por su menor coste es el emplear fluoróforos que se unen a DNA de doble cadena, como SYBR Green o Eva Green. El SYBR Green o el Eva Green se unen inespecíficamente al DNA de doble cadena y producen fluorescencia. Estos fluorocromos no son específicos ya que se unen a toda molécula de DNA de doble cadena, incluyendo los dímeros de primer. Otra alternativa, más cara pero recomendada cuando hay problemas de especificidad, es el uso de sondas específicas fluorescentes, como las sondas de hidrólisis TaqMan-MGB (Applied Biosystems) o UPLs (Roche). Esta técnica permite la cuantificacación específica del cDNA de interés incluso en la presencia de amplificación inespecífica (dímeros de primer, DNAg). [pic 1]

La genética forense no surge como tal, sino que evoluciona a partir de otra rama conocida como hemogenética forense; nace a principios del siglo XX, cuando Karl Landsteiner describe el sistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisión hereditaria. El objetivo de esta ciencia era la identificación genética en crímenes y casos de paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), proteínas séricas y enzimas eritrocitarias. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse una persona como posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigio biológico hallado en el lugar de los hechos. [pic 2]

Este documento describe el kit de cuantificación de ADN Quantifiler® HP

(Cat. No. 4482911) y Quantifiler® Trío kit de cuantificación de ADN (Cat.. Hay 4.482.910).

El kit Quantifiler® HP está diseñado para cuantificar la cantidad total de amplificable humana

ADN en una muestra. El kit Quantifiler® Trio está diseñado para cuantificar simultáneamente el

cantidad total de ADN humano amplificable y ADN masculino humano en una muestra. Al igual que con

nuestra Quantifiler® Duo, humano, y Cuantificación Kits de ADN masculino humano Y, éstos

kits utilizan la tecnología de PCR en tiempo real cuantitativa TaqMan®. Los resultados obtenidos utilizando

los kits pueden ayudar a determinar:

Si la muestra contiene suficiente ADN humano y / o ADN masculino humano a

proceder con el análisis de repeticiones cortas en tándem (STR).

• La cantidad de muestra para su uso en aplicaciones de análisis de STR.

• Para el Kit Quantifiler® Trio, únicamente las cantidades relativas de varón humano y

ADN femenino en una muestra que puede ayudar en la selección de la STR aplicable

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