El uso la técnica colorimétrica de Nelson y Ting para la determinación de la glucosa, la fructosa y la sacarosa

INTRODUCCIÓN

En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas.

Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales.

Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados, glucósidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos, aunque algunos azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria.

Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio:

Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.

Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Se puede utilizar el espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio, comparándola después con la radiación absorbida por un blanco. La regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una substancia con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede establecer como sigue:

Log Io = abc

I

En donde:

Io = Radiaciòn incidente o radiaciòn transmitida por el blanco.

I = Radiaciòn transmitida por la muestra.

Log Io = absorbancia de la muestra

I

En donde:

a = coeficiente de absorbancia (absortividad) – las unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinaciòn de la concentraciòn.

b = longitud de la celda usualmente en centìmetros.

c = concentraciòn de la muestra en las unidades apropiadas.

I

En esta práctica se empleará la técnica colorimétrica de Nelson y Ting para determinar glucosa, fructosa y sacarosa.

OBJETIVOS

El estudiante explicará por escrito el fundamento del método empleado para la determinación de azúcares en las muestras de frutas que se le asignarán.

El estudiante relacionará los contenidos de azúcares determinados en las muestras de diversos frutos.

El estudiante se concientizarà del concepto y los instrumentos de mediciòn utilizados en la espectrofotometrìa, y de la aplicaciòn de curvas estàndar utilizando el mètodo de Nelson y Ting.

MATERIAL

6 matraces volumétricos de 100 ml con tapón.

2 matraces volumétricos de 500 ml con tapón.

2 matraces volumétricos de 250 ml con tapón.

1 embudo de vidrio.

2 matraces Erlenmeyer de 125 ml.

6 pipetas de 10 ml.

2 pipetas de 1 ml.

2 pipetas de 5 ml.

2 vasos de precipitados de 250 ml.

1 baño María simple.

5 celdas de espectrofotómetro.

1 gradilla.

2 círculos de 10 cm de diámetro de papel filtro Whatman # 1.

Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante).

Algodón o gasa .

1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante).

1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante).

Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. En el caso del melón con 1 ejemplar basta (proporcionados por el estudiante).

EQUIPO:

1 extractor de jugos.

1 licuadora o mortero.

1 potenciómetro.

1 baño María con control de temperatura y agitación.

1 espectrofotómetro Spectronic 20'® a 515 nm.

REACTIVOS

Solución alcalina de Ferricianuro.

Solución de Arsenomolibdato (25 g).

H2SO4 2N.

NaOH 10N, 1N y 0.1N.

HCl 1:1 (Vol/Vol).

Na2CO3 anhidro. (12.5 g) ó

Na2CO3 monohidratado. (14.3 g).

Tartrato de potasio (12.3 g).

NaHCO3 (10 g).

Na2SO4 anhidro disuelto en 35º ml de agua destilada.

CuSO4 • 5H2O disuelto en 50 ml. de H2O.

Glucosa (300 µg/ml).

MÉTODO

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Reactivo de Nelson A.- Disuelva 12.5 g Na2CO3 anhidro (ó 14.3 g Na2CO3 • H2O), 12.3 g de tartrato de potasio, 10 g de NaHCO3 y 100 g de Na2SO4 anhidro en 350 ml de H2O y afore a 500 ml.

Reactivo

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