Espectrofotometria

LABORATORIO Nº1

ESPECTROFOTOMETRÍA: CUANTIFICACIÓN

1. Aspectos teóricos de espectrofotometría cuantitativa

La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación.

Todas las sustancias absorben luz en alguna región del espectro electromagnético (VIS, UV, IR, etc.).

La absorción de luz depende de la estructura química del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las características de su espectro de absorción.

A NAD+

NADH

260 300 340  nm

Figura 1. Espectros de absorción del NAD+ y del NADH.

Ley de Lambert-Beer

Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), también llamada densidad óptica (D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentración (c) de la sustancia absorbente, la longitud del paso de luz (l) (espesor de la solución) y una constante denominada coeficiente de extinción o coeficiente de absorción (a), que es característico para cada sustancia a una longitud de onda () determinada.

A = al c Ecuación 1.1

Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotómetro, instrumento destinado a medir la absorción por especies inorgánicas y orgánicas de luz monocromática en la región ultravioleta / visible del espectro.

Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relación entre ambos es:

A = 2 - log % T Ecuación 1.2

Análisis espectrofotométrico:

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión.

Curva de Calibrado :

Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo método y medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para medir la concentración de una sustancia se elige por lo general, la región de máxima absorción del espectro, denominada longitud de onda analítica.

El resultado se expresa en una gráfica de la absorbancia (A) en función de la concentración (c). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una línea recta que pasa cerca del origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de extinción (a) (Ecuación 1.3).

Es posible determinar gráficamente la concentración de una muestra desconocida (cx) midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibrado.

Normalmente la concentración se estima, a partir de la ecuación de la curva de calibrado.

A = al c + Ao Ecuación 1.3

Donde, A es la variable dependiente (y), la pendiente es igual a (a • l), c es la variable controlada (x) y Ao es el intercepto.

Las unidades del coeficiente de extinción dependen de las unidades de concentración y de longitud del paso de luz. Generalmente la unidad de longitud es el centímetro y la longitud del paso de luz es 1,0 cm. Si las unidades de concentración son moles L-1 o milimoles L-1, se hace referencia al coeficiente de extinción molar ( o milimolar, respectivamente (Ecuación 1.4). Si la concentración está expresada en g/100 mL (% peso / volumen) se obtiene el coeficiente de extinción específico (E1%).

A = l c + Ao Ecuación 1.4

Cuando la concentración de la sustancia y la longitud del paso de la luz se hacen iguales a la unidad, la absorbancia corresponde al coeficiente de extinción. Si se midiera la absorbancia de una solución 1,0 M de una sustancia colocada en una celda de 1,0 cm se obtendría el coeficiente de extinción molar (). Si la concentración fuera 1,0 g/100 mL se obtendría el coeficiente de extinción específico (E1%). Estos coeficientes son una propiedad específica de las partículas absorbentes y su valor es referido a un determinado solvente y a una determinada longitud de onda.

Cuando se conoce por bibliografía el coeficiente de extinción de un compuesto (E1%), o éste es estimado experimentalmente, midiendo la absorbancia (AX) de una muestra del compuesto de concentración desconocida (cX) se puede calcular su concentración (ecuación 1.5).

Ecuación 1.5

En esta forma se obtiene la concentración (cf) de la muestra problema en la cubeta, para obtener la concentración original (ci) se debe considerar las diluciones correspondientes al ensayo usado para cuantificar (Ecuación 1,6).

Ecuación 1.6

Fórmula del Estándar.

La concentración desconocida puede determinarse sobre la base de un sólo estándar, de acuerdo a la siguiente ecuación:

Ecuación 1.7

As y Amp son las absorbancias del estándar y muestra problema, respectivamente.

vi corresponde al volumen de la solución estándar o de la muestra problema ocupado en el ensayo para cuantificar.

vf corresponde al volumen final del ensayo ocupado para cuantificar.

cs y cmp corresponden a las concentraciones de las soluciones estándar y

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