Espectrofotometria

ESPECTROFOTOMETRÍA

PRESENTADO POR:

GARCÍA VILORIA LEONARDO FABIO

HERNÁNDEZ GALVÁN NATHALIE

GARZON NELSON FERNANDO

VIZCAÍNO REDONDO JORGE ELIECER

VÉLEZ TORRES JOHANA CAROLINA

PRESENTADO A:

Prof. VARGAS ZAPATA CARMIÑA LUCIA

UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

FACULTAD DE QUÍMICA Y FARMACIA

TERCER SEMESTRE

BIOQUÍMICA

GRUPO #3

AÑO 2010

INTRODUCCIÒN

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:

El fotón = h×n = h×c/l,

Donde c es la velocidad de la luz, n es su frecuencia, l su longitud de onda y h= 6.6 10-34 J×s es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda l, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda.

En esta práctica estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano (l»325-420nm) y en el visible (l»420-900 nm). Cuando una molécula absorbe un fotón en este intervalo espectral, se excita pasando un electrón de un orbital del estado fundamental aun orbital excitado de energía superior. De esta manera la molécula almacena la energía del fotón:

A + h×n ® A*

E(A*) = E(A) + El fotón

Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado fundamental de la molécula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energía del fotón. Es decir, una molécula sólo puede absorber fotones cuya energía h×n sea igual a la energía de un estado molecular excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrónica y que la distinguen del resto de moléculas. Como consecuencia, el espectro de absorción, es decir, la luz absorbida en función de la longitud de onda, constituye una verdadera señal de identidad de cada sustancia o molécula.

En una ampliación a esta práctica, se puede detectar una mezcla de dos colorantes alimentarios, el rojo E-124 y un colorante verde midiendo su espectro de ultravioleta/visible. Cuando dos o más sustancias aparecen mezcladas en una misma muestra sus espectros de absorción aparecen superpuestos. Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado espectrómetro.

Los instrumentos que vamos a usar en esta práctica constan de una fuente de luz “blanca” caracterizada por un espectro de emisión continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda (en nuestro caso 325 nm-900 nm) y de un monocromador que actúa como filtro óptico transmitiendo un haz de luz de longitud de onda fija l e intensidad I0. Este haz de luz penetra en la cubeta de análisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la intensidad del haz a la salida

La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta debida a la absorción de las moléculas de la muestra. El ritmo de absorción depende de la intensidad inicial de luz y de la concentración de moléculas. De esta manera, cuando un haz de luz de intensidad I recorre una distancia dL en una muestra con una concentración de moléculas [B], se produce una atenuación de intensidad dI dada por:

dI = - k × [B]× I × dL

La constante k se denomina coeficiente de absortividad molar.

lo cual da lugar a la ley de Beer-Lambert1 para la absorción que relaciona la intensidad con la salida de la muestra If, con la intensidad inicial I0, la concentración de moléculas y la distancia recorrida por la luz en la muestra, L:

El espectrofotómetro, en lugar de la intensidad, mide la absorbancia A que se define por:

A º ln I0 = k ×[B]. L

I f

La utilización de la absorbancia al realizar los espectros tiene la ventaja de ser directamente proporcional a la concentración de moléculas en la muestra.

El espectro electromagnético:

Desde Newton, sabemos que la luz blanca se descompone en los colores que la integran si la hacemos pasar a través de un prisma. Es el efecto que se repite, por ejemplo en el arco iris, el cual se dice es el espectro de la luz visible procedente del sol, son las gotas de lluvia y el aire atmosférico lo que hacen de espectroscopio. La principal emisión de radiación de los cuerpos es la radiación electromagnética en forma de luz visible, de la misma manera cada elemento químico absorbe y emite luz de colores que componen su espectro.

La longitud de onda de la radiación puede ser desde muy pequeña, en el caso de la llamada radiación gamma, hasta muy grande en las ondas de radio. Se mide, pues, usando desde nanómetros y ángstroms hasta cientos de metros. Recordemos que un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro (1 m = 109 nm) y que un Ángstrom es la diez mil millonésima parte de un metro (1 m = 1010 A), por lo que un nanómetro equivale a 10 Ángstrom (1nm = 10

La luz que recibimos del Sol es radiación electromagnética que se desplaza a 300.000 Km/s, en su totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos los fotones luminosos, sino que varía entre los 4000 A y los 7000 A, aproximadamente, o lo que es lo mismo, entre los 400 nm y los 700 nm. La luz blanca se descompone,

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