Extraccion Y Electroforesis

PRACTICA No.13

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA

POR EL METODO DE SALTING OUT

1. MARCO TEORICO

El ADN es el material que en su estructura almacena la información que requiere cada célula para la ejecución de una infinidad de funciones. En las células eucarióticas, el ADN se encuentra localizado exclusivamente en el núcleo, y la información que el ADN expresa debe proyectarse a todos los ámbitos celulares. Este flujo de información ocurre según el dogma de la biología molecular, suele representarse como:

ADN → ARN → Proteínas.

La genética molecular estudia las estructura y la función del ADN. La información que se almacena en esta molécula, dicta la síntesis del ARN mensajero, el cual madura y migra al citoplasma, donde dirigirá la síntesis de proteínas. Las células son las unidades funcionales del organismo que operan siguiendo las pautas que le imponen el conjunto de proteínas sintetizadas. Estas regulan los géneros de mantenimiento, división, comunicación y muerte celular. Las proteínas a su vez, dirigen la síntesis de ADN, con lo que se completa el ciclo.

Los ácidos nucleicos son polímetros de nucleótidos, los cuales constan de una base nitrogenada, una pentosa y un grupo fosfato. El tipo de pentosa determina que el ácido nucleico sea ADN o ARN. En el ADN la pentosa es la 2-desoxirribosa, mientras que en el ARN es la ribosa. La ausencia de un grupo hidroxilo en el carbono 2' de la pentosa da al ADN una gran resistencia a la hidrólisis alcalina, contrariamente al ARN, que a pH básico y a 37 ºC, se rompe los nucleótidos en pocos minutos.

Las bases nitrogenadas corresponden a dos categorías: purinas y pirimidinas. Las dos purinas, adenina (A) y guanina (G) están presentes tanto en el ADN como en el ARN. En cuanto a las pirimidinas, el ADN posee citosina (C) y timina (T), mientras que en el ARN, la timina (T) esta sustituida por el uracilo (U).

El ADN es una doble cadena en la que las bases se encuentran en el interior de la molécula y los grupos fosfato en el exterior. La unión entre las bases complementarias se realiza a través de puentes de hidrógeno: dos para A y T, y tres para G y C. La ruptura de los puentes de hidrógeno por calor, álcali o compuestos químicos produce la separación física de las dos hebras del ADN y se denomina desnaturalización. Compuestos químicos como la urea o la formamida, son agentes desnaturalizantes que interfieren reaccionando directamente con las bases e impidiendo un apareamiento correcto entre ellas, a temperaturas a las que normalmente estarían apareadas. El formaldehído es otro agente desnaturalizante, cuya acción es irreversible porque establece uniones covalentes con los grupos NH de las bases e impide el apareamiento de estas.

Las células poseen un contenido de ADN constante, que es característico de cada especie. El aislamiento y la purificación del ADN, es un paso clave en la mayoría de los protocolos de Biología Celular y Molecular. En este practica se realizara la purificación de ADN de una muestra de sangre. Debido a que el ADN coexiste con el ARN y otras macromoléculas, durante los pasos de extracción, es necesario liberar el ADN de todos estos compuestos celulares. La purificación del ADN ha permitido la clonación de genes y construcción de librerías de ADN genómico de diferentes especies. En ambos tipos de aislamiento, a menudo es necesario realizar purificación y fraccionamiento del ADN (digestión con enzimas de restricción) o la amplificación de secuencias especificas.

2. OBJETIVOS

• Utilizar una metodología fácil y asequible para la purificación del ADN.

• Extraer por el método de salting out el ADN de una muestra de sangre.

• Deducir algunas de las propiedades físico químicas de los ácidos nucleicos por medio de la metodología seguida.

3. MATERIALES Y EQUIPOS

• Jeringas de 5 cc

• Vacutainer con EDTA

• Viales de 1.5 mL

• Micropipetas de 10, 20, 200 y 100 μL

• Vortex

• Centrífuga

• Pipetas Pasteur

• Guantes Quirúrgicos

• Marcadores Indelebles de Punta Fina

4. REACTIVOS

• Solución Madre de Tris 0.5 M pH 7.4

• Solución Madre de Tris 0.5 M pH 7.5

• Solución Madre de EDTA 0.5 M pH 8.0

• Solución Madre de Sacarosa 1 M

• Solución Madre

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