EXtracción,PCR y Electroforesis

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Facultad de Ciencias de la Salud

Medicina Humana

INFORME DE BIOLOGÍA CELULAR

Curso: Laboratorio de Biología Celular

Profesor: Sanchez Garcias, Gerardo Junior

Alumnos:

• Franco Aguirre, Luis Fernando

Horarios de Practicas:

Día: Martes 29 Oct. – 5-12 Nov.

Horario: 1:10 pm – 3:00 pm

Fecha de entrega: 19 Nov.

Lima – Perú

2019- II

INTRODUCCIÓN:

1. Marco teórico:

Extracción de ADN

Se llama extracción al método por el cual se obtine ADN a paritr de material biologico (Sangre) utilizando tecnicas físicas y químicas. La extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo, desarrollar terapia genéticas, análisis forenses, prueba de pateridad, etc.

Existen distintos tipos de extracción de ADN como:

• Kit de extracción Purelink-genomic (invitrogen)
• Mediante resina CHELEX – 100
• Metodo de Salting - Out

El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material incial ya sea de origen viral y bacteriano vegetal o animal. El método utilizado para romper la célula deber ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor daño posible al ADN.

La lisis celular se puede hacer por accion macanica pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno liquido, tambien se puede utilizar la degradación enzimática de la pared celular y lisis con detergente de las membranas celulares. Seguido al rompiento celular la mayoria de métodos involucran una desproteinización lo cual se lleva a cabo con un oslvente orgánico seguido de una precipitación con isopropanol o etanol y psoteriormente solubilizar con agua o tampón.

Existan diferentes tecnicas para la extraccion del ADN, aunque todas conservan el uso de los mismos principios y fundamentos.

Los criterios básicos que deria cumpliar un método para purificar ADN de cualquier origen incluyen:

1. Extracción eficiente
2. Cantidad de ADN purificado suficiente para las subsiguientes aplicaciones
3. Eliminación de contaminantes
4. Calidas y pureza del ADN

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http://blog.analitek.com/extraccion-y-purificacion-de-adn-introduccion-e-importancia-de-la-extracciondel-adn-0-0-1

PCR

La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción d¿en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para llevar a cabo el experimento de amplificación en necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte del gen, una región no codificado).

Básicamente, se trata de replicar varias veces un mismo  fragmento de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vitro  para replicar su ADN.

Así, se trata de disponer de un tubo de ensayo el ADN de la especie de objeto de estudio. Además, debemos añadir en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para el ADN polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos (cebadores o primers) es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar. En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3’ de la region a amplificar:

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Comprende varios ciclos divididos en tres etapas:

1. Desnaturalización (96° C): La reacción se calienta bastante para serparar, o desnaturalizar las cadenas de ADN. Esto proporcionar los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso
2. Hibridación o anillamiento (55° - 66° C): La reacción se enfria para ello los cbadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
3. Extensión (72°C): La temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice asi nuevas cadenas de ADN.

Este ciclo se repite 25 – 35 veces en una reacción de PCr tipica, que dura generalmente de 2 a 4 horas, según la longitud de la región de ADN que se copia.

Eso es por no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce en un ronda puede servir como molde en las siguientes ronda de sintesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moleculas de Taq polimerasa flotando en la reaccion, por lo que el número de moléculas de ADN casí puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento exponencial.

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https://www.thermofisher.com/pe/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-basics.html

Una polimeraza resiste a la desnaturalización por calo, la Taq Polimerasa llamada asi por las bacteria termófila Thermus Aquaticus, de la que se habia aislado, extiende los extremos 3’ de ambos oligonucleótidos utilizando las hebras del ADN bicatenario como plantilla, proceso que se conoce como «extensión del cebador» (primers extensión).

Una última desnaturalización pone fin a un ciclo y da comienzo al siguiente. Al cado del primer ciclo se obtine dos moléculas bicatenarias del ácido nucleico original.

El ciclo anterior se repite muchas veces (el número óptimo es de 20 a 50 veces en una PCR típica), sin añadir más enzimas y usando las moléculas obtenidas en el ciclo anterior como plantilla. De esta forma se produce un aumento exponencial del número de copias de las secuencia específica iguala 2n, donde n es el npumero de ciclos.

Una vez realizada la PCR debemos confirmar la amplificación. El método más habitual es la electroforesis en la que comprobamos si el tamaño del producto es adecuado. Esto no es suficiente si queremos ppor primera vez establecer una PCR como prueba clínica.[pic 5]

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