PCR Y ELECTROFORESIS DE DNA EN E.COLI

PCR Y ELECTROFORESIS DE DNA EN E.COLI

RESUMEN

La práctica se fundamentó en la realización de una PCR y posteriormente una electroforesis a las muestras de ADN extraídas en prácticas anteriores, para ello primero se procedió a realizar el (Cóctel) el cual contenía cada uno de los elementos a usar empezando entre ellos se encontraban el buffer, los cebadores, dNTPs, enzimas, etc. Una vez preparado el coctel se dividió en 7 μL se le  adición los 3μL de ADN  las muestras se llevaron al Termociclador y se ajustó con el número de ciclos, temperatura y tiempos estipulado pro al guía de laboratorio. Luego de haber obtenido la ampliación se procedió a la realización de la electroforesis donde primero se procedió a la preparación de la cámara de electroforesis teniendo en cuenta como aspecto principal el equilibrio de esta asegurándose de que no presentara ningún declive. Más adelante se realizaron cálculos para la preparación del buffer y la matriz de gel donde se realizaron procesos de calentamiento enfriamiento y disolución, para finalmente llevarla a la cámara de electroforesis donde se le introdujo el peine para separar los posos para el ADN. Finalmente no se obtuvieron resultados positivos debido a que las muestras corrieron sin mostrar el ADN contenido.

Palabras Claves: E. collí, buffer, electroforesis, cepa, ADN.

Abstract

The practice was based on the realization of a PCR and, later, an electrophoresis in the samples of DNA extracted in previous practices, for it first proceeded to realize the (Cocktail) which contained each one of the elements to use beginning between them they were the buffer, the primers, dNTPs, enzymes, etc. Once the cocktail was prepared, it was divided into 7 μL and the 3 μL of DNA was added, the samples were taken to the Thermal Cycler and adjusted according to the number of cycles, temperature and times stipulated for the laboratory guide. After having obtained the approval, the electrophoresis was carried out where the electrophoresis chamber was first prepared taking into account the main aspect, the equilibrium of which assured that it did not show any decline. Later, measurements were made for the preparation of the buffer and the gel matrix where the electrophoresis process was carried out, where the comb was introduced to separate the sludge for the DNA. Finally, no positive results were found because the samples ran without displaying the contained DNA.

Keywords: E. coli, buffer, electrophoresis, strain, DNA.

INTRODUCCIÓN.

La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora,). Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su ADN. [1]

Así, se trata de disponer en un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto de estudio. Además, debemos añadir en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para el ADN polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos (cebadores o primers) es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar. En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar.

La PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar. [3]

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opción de realizar la reacción de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicará calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluían este sistema tenían que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensación de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases: líquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga-masa. Por ejemplo, si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazará más rápido hacia un electrodo (Voet and Voet, 2006). Dado que muchas proteínas o ácidos nucleicos de tamaño y forma diferentes tienen relaciones carga-masa casi idéntica, la electroforesis de estas macromoléculas en solución se traduce en muy escasa o nula separación. No obstante, es posible lograr la separación de proteínas y ácidos nucleicos mediante electroforesis en distintos geles (suspensiones semisólidas en agua) en lugar de hacerlo en soluciones líquidas (Lodish, 2005). La separación electroforética de ADN se suele efectuar en geles de agarosa. [1]

El objetivo de la práctica fue amplificar ADN de E. coli utilizando cebadores específicos y posteriormente realizar una electroforesis.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Reacción en cadena  de la polimerasa o PCR

Para la realización de la PCR se llevaron a cabo una serie de pasos que van de la mano con unos componentes indispensables para poder realizar dicha técnica primeramente se utilizó una muestra de ADN la cual fue extraída previamente de una sepa de E. coli en concreto la Escherichiacoli  Cepa K12 [ATCC ® 10798] del kit comercial Bacterial Transformación Kit de Carolina, posterior a esta se procedió a preparar el coctel de soluciones que contenían Buffer de pcr 7 μL, MgCl2 5,8 μL, Dnt 7μL, taq polimerasa 14 μL, Cebadores con sus respectivas secuencias  Fd2: AGAGTTTGATCATGGCTCAG, rP1:ACGGTTACCTTGTTACGACTT, estos cebadores pertenecen a un grupo se cebadores llamados universales porque tienen la capacidad de amplificar el gen 16s ribosomal con una capacidad de 1500 pb en una amplia gama de bacterias entre las cuales se encuentra E. coli también usamos los cebadores Fme: TATTGGTATGCGAAACTTCCG y Rme: ACAGAAACTGATACTTATATAGCG los cuales son usados en leishmania spp) para amplificar la región espaciadora no transcrita del miniexon1,  luego se adiciono agua ultra pura 2,8 μL, una vez mezclados todos los componentes dio un volumen total de 50 microlitros de coctel de PCR, luego se le se dividió en cantidades de 7 μL y se procedió adicionarles 3 μL de la muestra de DNA previamente obtenida.

Una vez se tiene todo listo es donde entra en juego el termociclador que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Como he dicho cada etapa requiere ciertas temperaturas para que el coctel de sustancias anteriormente mencionado pueda trabajar, estas etapas ocurren por ciclos, cada ciclo consta de una temperatura en específico a las cuales están asociadas ciertas sustancias, una vez descrito el perfil de cómo trabaja el termociclador se procedió a  dejar la muestra en el termociclador en unos tubos eppendorf especiales los cuales tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Cuando ya han trascurrido el tiempo establecido según el protocolo.

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