Electroforesis de DNA leucocitario

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                                                       Reporte

Práctica 2. Aislamiento y purificación de DNA por la técnica de perclorato de sodio y electroforesis de DNA.

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Equipo: 8

Integrantes:

Fernández Hernández María José

Valdés Alvarez Cassandra Araceli

Fecha de realización de práctica: 03 y 10 de septiembre de 2019

Fecha de entrega: 17 de septiembre de 2019

Semestre 2020-I

Abstract

The DNA molecule is a nucleic acid that contains genetic instructions used in the development and operation in all the living organisms and some viruses; is also responsible of the hereditary transmission. This practice was done with the final purpose of extract the genetic material coming from venous blood, using the sodium perchlorate method (grounded in the salting-out principle). This method was selected because of the low-cost of the reactants and the low grade of toxicity they have for alumni.  The genetic material obtained came from the nucleus of the leukocyte cells, then, they were purified from erythrocytes and finally lysed with lysis buffers 1 and 2. The addition of surfactant (SDS) and perchlorate: inactive enzymes, precipitates polluting proteins and elevates sample purity. Sodium chloride removes SDS residues and forms an ion layer covering DNA. Finally, the alcohols decrease the dielectric constant of the water helping to separate it from the aqueous phase. As a result, a whitish button was obtained in which the DNA is contained; it was resuspended in sterile water and reserved for later use for electrophoresis and PCR and assessed its composition and purity. During the electrophoresis, we have used a fluorometer called Ethidium Bromide which helped us to reveal the electrophoresis bands (by application of UV light) and observed the quality and purity of our DNA samples.

Key words:   DNA, extraction, sodium perchlorate, blood, leukocytes, purity, Salting out, electrophoresis, Ethidium Bromide

Resumen

La molécula de ADN es un ácido nucleico que contiene las instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos y algunos virus; también es responsable de la transmisión hereditaria. La siguiente práctica se realizó con el fin de extraer material genético proveniente de sangre venosa mediante el uso del método de Perclorato de Sodio NaClO4 (fundamentado en el principio de salting out). Este método fue elegido por los bajos costos que representa a la institución y los bajos niveles de toxicidad a los que se podrían enfrentar los alumnos. El material genético obtenido provino de núcleos celulares leucocitarios los cuales fueron purificados de eritrocitos y posteriormente lisados por medio del uso de buffers de lisis 1 y 2. La adición de tensioactivo (SDS) y Perclorato inactiva enzimas, precipita proteínas contaminantes y eleva la pureza de la muestra. Con el cloruro de sodio se eliminan residuos de SDS y se forma una capa iónica que cubre al ADN. Finalmente, los alcoholes disminuyen la cte. Dieléctrica del agua y nos ayudan a separarlo de la fase acuosa. Como resultado se obtuvo un botón blanquecino en el cual está contenido el ADN; se resuspendió en agua estéril y se reservó para utilizarse posteriormente para electroforesis y PCR y evaluar su composición y pureza. Durante la realización de electroforesis se utilizó un fluorómetro llamado Bromuro de Etidio el cual nos ayudó a revelar las bandas de la electroforesis (por aplicación de luz UV) y observamos la calidad y pureza de nuestras muestras de ADN.

Palabras Clave: ADN, extracción, perclorato de sodio, sangre, leucocitos, pureza, salting out, electroforesis, bromuro de etidio

Introducción

Desde el origen de la genética se propuso la existencia de un factor que hacia posible la herencia: un material hereditario. Desde Gregor Mendel en 1865 ya se mencionaban estos dichosos factores hereditarios. Posteriormente, en 1868, Darwin también se refería a dichos factores con la teoría de pangénesis, en donde trataba de dar explicación a la herencia de ciertas características entre las diversas generaciones de individuos que existían en las especies, argumentando que se transmitían por ser transportadas hasta las gónadas. En 1920 Thomas Hunt con estudios en Drosophila melanogaster logró establecer a los cromosomas como el soporte físico de la herencia y definirlo como el lugar donde residen los factores mendelianos. Posteriormente se dieron infinidad de estudios para averiguar los mecanismos de la herencia. Se logró descifrar su composición se denominó el ácido desoxirribonucleico (ADN) y se logró comprender que éste es el soporte físico de información genética. No fue hasta casi 100 años después de los inicios de la genética, donde, gracias a todos los estudios de años anteriores cuando Rosalind Franklin logró conseguir la famosa fotografía de la estructura del ADN y la cual es la responsable de la herencia.

Hoy en día se sabe que el ADN se encuentra en las células y se traspasa la información de madre a células hijas, y aunque todos los seres vivos seamos distintos, todos tenemos características en común como la estructura del DNA que nos compone: formado por Adenina, Timina, Citosina y Guanina, enrollado en doble hélice.

Actualmente la extracción de ADN puede hacerse hasta en casa basándose en diversos fundamentos. Hace algunos años la extracción más común se hacía con solventes orgánicos (fenol), pero hoy en día la tecnología genética ha crecido y se implementan cada vez mejores métodos de extracción que nos aseguran pureza y todo por un menor tiempo (con costos variables) lo que nos abre el mundo de la comercialización.

Durante el desarrollo de esta práctica se pone en función el fundamento de cambios de concentración salina con perclorato de sodio por su baja toxicidad y el bajo costo que representan. La extracción se hace de células sanguíneas (leucocitos) por ser de fácil acceso y la posibilidad de obtener una buena cantidad de muestra. La lisis de las células nos utiliza para liberar el material genético y para ir limpiando nuestra muestra de componentes innecesarios. El tensioactivo y las sales nos sirven para inactivar enzimas y precipitar proteínas que no nos son útiles, elevando la pureza de la muestra. Finalmente, el NaCl nos sirve para eliminar los reactivos y los alcoholes para poder retirar de la fase acuosa a nuestro material genético.

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