Electroforesis de DNA INTRODUCCIÓN

Práctica número 5: Electroforesis de DNA.

Presenta: González Pérez Joshua Tlacayellel

Asignatura: Biología Molecular

Licenciatura QFBT

Periodo 2018-01 

Fecha de entrega: 10/Abril/2018

Docente: Gustavo Salas Lais

        I.         INTRODUCCIÓN

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras macromoléculas, como ARN y proteínas) por su tamaño y carga. La electroforesis consiste en aplicar una corriente a través de un gel que contiene las moléculas de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras.

La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.

La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética. La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN. Éste es exactamente el principio en que se basa la electroforesis de ácidos nucleicos. Sometidos a un campo eléctrico, la carga neta negativa del ADN y el ARN hará que estos se muevan en dirección al ánodo. Si se fuerza a los ácidos nucleicos a moverse a través de un gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción hará que las moléculas de mayor tamaño migren con más [pic 1]

lentitud, mientras las de menor tamaño         Ilustración 1. Fundamento de electroforesis de

ADN 

avanzan más en el gel, permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función de su tamaño. Del mismo modo, moléculas de ADN o ARN con topologías o estructuras tridimensionales diferentes también se comportarán de forma diferente ante la fricción con la malla del polímero, permitiendo su separación.

En biología molecular, las técnicas de electroforesis de ADN tienen una gran importancia para separar, purificar los ácidos nucleicos (también proteínas), La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia de las proteínas, que pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogeneizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo; sólo se separarán por tamaño. El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.

II.         OBJETIVO

Comprender los conceptos y técnicas de la electroforesis en agarosa paras aplicarlos en el laboratorio y analizar las muestras de ADN por éste técnica.  III. HIPÓTESIS

Demostrar la utilidad de la electroforesis por ácidos nucleicos.

IV.         METODOLOGÍA

Preparar gel para electroforesis 1% agarosa, calentando 1 g de agarosa y 100 mL de buffer TAE 1X

hasta disolver

Sobre papel parafilm hacer una mezcla con 5 µL de DNA + 3 µL de colorante buffer de carga + 2 µL de agente        intercalante (sustituye        al        bromuro        de etidio), homogeneizar[pic 2]

Colocar con una micropipeta las muestras de DNA en los pozos (10 µL).

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V.         RESULTADOS 

Verter el gel en la cámara sin formar burbujas, insertar la peinilla y mantenerla estática hasta que se polimerice.

. En uno de los pozos de los extremos colocar 4 µL Ladder 100 pb con 3 µL de colorante buffer de carga.

Aplicar una corriente de 90-120 V durante 40-60 minutos aproximadamente.

. Remover la peinilla y colocar en un tanque de electroforesis el gel de modo que las muestras migren del cátodo al ánodo. Añadir suficiente buffer TAE 1X hasta cubrir el gel.

Colocar con una micropipeta las muestras de DNA en los pozos (10 µL).

Dejar migrar las muestras hasta que la línea del tinte se encuentre hasta la zona deseada. Observar a la luz UV

L= Leader  B+= Bacteria           H+= Hongo          C+=         Clamidia         He+=

Hipervirus

[pic 3]

Ilustración 2. Cuantificación de ADN amplificado por PCR

Tabla 1. Aproximado de pares de base respecto a Leader.

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