Electroforesis y PCR.

[pic 1][pic 2]Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca

Facultad de ciencias químicas

Lic. Químico farmacéutico biólogo

Laboratorio de biología molecular

Practica: PCR y Electroforesis

Alumna: Ordoñez Antonio Ana Karen

Catedrático: Dr. Hernández García Ericel  

Grado: 4 semestre      grupo: B

Introducción:

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en inglés Polymerase Chain Reaction) permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonulceico). El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA.

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Electroforesis:

La electroforesis es el proceso de movimiento de moléculas cargadas en una solución al aplicar un campo eléctrico. Debido a que las moléculas en un campo eléctrico se mueven a una velocidad dependiente de su carga, forma y tamaño, la electroforesis se ha desarrollado ampliamente para la separación de diversas biomoléculas. Debido a que es una herramienta analítica simple y relativamente rápida, se utiliza para el análisis y la purificación de moléculas grandes como proteínas y ácidos nucleicos o de moléculas pequeñas como azúcares, aminoácidos, péptidos y nucleótidos. La electroforesis de macromoléculas se realiza normalmente aplicando un volumen pequeño de la muestra en una matriz porosa. Bajo la influencia del voltaje aplicado, las diferentes moléculas presentes en la muestra se moverán a través de la matriz a diferentes velocidades. Al final se podrá observar la separación de las moléculas detectadas como bandas en distintas posiciones dentro de la matriz. La matriz puede estar compuesta por diferentes materiales como papel, acetato de celulosa, agarosa o poliacrilamida. Los ácidos nucleicos son comúnmente separados en geles de agarosa. La agarosa es un polisacárido altamente purificado, derivado del agar. La velocidad de migración del ADN en matrices de agarosa está determinada por: Tamaño molecular del ADN, forma o conformación, entre otros.

Objetivos generales:

1. Realizar correctamente una electroforesis con muestra de DNA.
2. Lograr la correcta replicación de un fragmento de DNA mediante PCR.

Objetivos específicos:

 PCR

• Entender el fundamento teórico de la PCR para la replicación artificial de un fragmento de DNA.
• Realizar adecuadamente los pasos de la PCR para obtener una replicación artificial optima de un fragmento de DNA.
• Describir el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
• Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.
• Preparar una PCR

Electroforesis

• Entender la teoría de la electroforesis en el gel de agarosa para la separación de moléculas.
• Por medio de la electroforesis en gel de agarosa lograr una adecuada visualización de DNA.

Materiales:

PCR

• Micro pipetas
•  Tubos para PCR
• Termociclador
• Primer 1=   0.6 microlitro x 7 = 4.2 microlitro
• Primer 2=   0.6 microlitro x 7 = 4.2 microlitro
• Buffer 10x = 2.0 microlitro x 7 = 14.0 microlitro
• dNTP´s = 0.8 microlitro x 7 = 5.6 microlitro
• MgSO4 = 0.8 microlitro x 7 = 5.6 microlitro
• Enzima = 0.5 microlitro x 7 = 3.5 microlitro
• H2O = 12.7 microlitro x 7 = 88.9 microlitro
• DNA= 2.0 microlitro

ELECTROFORESIS

• Micropipetas
• Vidrio
• Peine
• Vidrio
• Separadores
• Tanque de electroforesis vertical
• Soporte
• Buffer
• Bromuro de etidio para teñir

Procedimiento:

PCR

• Utilizar las medidas de protección adecuadas para la realización de esta práctica.
• Lo primero que hay que hacer es prepara un master mix las cuales está conformado por lo siguiente:

                                                 Master Mix

        Primer 1=   0.6 microlitros x 7 = 4.2 microlitros

         Primer 2=   0.6 microlitros x 7 = 4.2 microlitros

         Buffer 10x = 2.0 microlitros x 7 = 14.0 microlitros

         dNTP´s = 0.8 microlitros x 7 = 5.6 microlitros

         MgSO4 = 0.8 microlitros x 7 = 5.6 microlitros

         Enzima = 0.5 microlitros x 7 = 3.5 microlitros

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