Extracción De Adn

La presente práctica se puede realizar perfectamente en una cocina normal de una casa. Es más, en un laboratorio de un centro de enseñanza media es frecuente que no se disponga de aparatos o reactivos necesarios para llevarla a cabo y que, por el contrario, siempre hay en una cocina (nevera con congelador, batidora, hielo, etc.)

MATERIAL Y REACTIVOS

• Muestra vegetal

• Agua (destilada o mineral)

• Sal de mesa

• Bicarbonato sódico

• Detergente líquido o champú

• Alcohol isoamílico a 0ºC • Batidora

• Nevera

• Colador o centrífuga

• Vaso

• Tubo de ensayo

• Varilla fina

FUNDAMENTO

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico, probablemente el único reactivo de esta práctica que no suele haber en una cocina.

REALIZACIÓN

1. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado:

o 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. No usar agua del grifo.

o 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.

o 5 g de bicarbonato sódico.

o 5 ml de detergente líquido o champú.

2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.

3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente.

4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador lo más fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.

5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su estremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.

RESULTADOS

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

EXTARCCION DE ADN DE TEJIDO VEGETAL

Objetivo

En esta práctica realizaremos la extracción del ADN de las células de pulpa de plátano poniendo de manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de arrollamiento, que permite el empaquetamiento en el núcleo celular de larguísimas cadenas de esta molécula.

Tras la extracción se realizará una tinción específica del ADN obtenido.

Material necesario

- Un plátano - Batidora de mano - Matraz

- Filtro tipo cafetera - Embudo para filtrar - Alcohol 96º muy frío

- Pipeta Pasteur - Tubo de ensayo - Gradilla

- Vaso para batir - Agua destilada - Espátula

- Vaso de precipitados - Detergente tipo lavavajillas - Un poco de sal común

Fundamento

El ADN se encuentra en el interior del núcleo de todas las células, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar la cromatina. Por lo tanto, podremos extraerlo a partir de prácticamente cualquier material de origen biológico. Para ello es necesario homogeneizar el tejido disgregándolo y separando sus células y demás componentes, luego romper las células para separar el núcleo y romper éste para liberar el ADN, separarlo de las proteínas y precipitarlo para separarlo de la solución acuosa. El ADN (y también algo de ARN) aparecerá entonces como un agregado de fibras blanquecinas de aspecto mucoso que se adhieren a una varilla de vidrio o a la pipeta. Podemos añadir unas gotas de azul de metileno o verde de metilo al tubo para teñirlo. Por último, se puede situar sobre un porta, teñirlo de la misma manera y observarlo al microscopio. También se puede conservar dejándolo secar sobre papel de filtro o suspendido en alcohol al 50% o 70%.

Procedimiento

1. Batir un plátano en 250 ml de agua destilada (o mineral en su defecto, pero no del grifo) durante 15 a 20 segundos hasta obtener una papilla homogénea.

2.

2. Por otra parte, en un vaso de precitados pequeño se mezcla una cucharada de champú o lavavajillas líquido con dos pizcas de sal de mesa.

3. Añadir 20 ml de agua destilada a la mezcla de champú y sal.

4. Añadir ahora tres cucharaditas del puré de plátano a lo anterior y mezclar con la espátula durante 5 ó 10 minutos evitando formar espuma.

Durante este tiempo se pueden preparar los tubos de ensayo como se describe en el siguiente punto y discutir la acción que desempeñan el detergente y la sal.

5. Preparar un tubo de ensayo con alcohol etílico

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