Fosfatasa Reporte

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL. 2013-2

PRÁCTICA 2. CINÉTICA ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

INTEGRANTES:

Ensina Hernández Marina

Jiménez Guevara K. Victoria

Jiménez Rodríguez Omar

Ortega Pérez Christian I.

Sánchez García Gabriela G.

OBJETIVO

El alumno será capaz de analizar las respuestas que se observan en la velocidad de la reacción enzimática, en función de diferentes factores como son el progreso de la reacción, el pH, la temperatura, la concentración de sustrato e inhibidores. Así mismo establecerá las condiciones de ensayo para determinar la actividad enzimática.

HIPÓTESIS

Al modificar ciertos factores físicos (temperatura), químicos (concentración de sustrato) o fisicoquímicos (pH), se verá modificada la actividad enzimática, reflejado en la velocidad de reacción, debido a cambios de tipo conformacionales, de carga, entre otros.

RESULTADOS

Como sustrato de la fosfatasa alcalina se utilizó un compuesto artificial: p-nitrofenilfosfato que, al poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser hidrolizado por la enzima.

La hidrólisis del sustrato forma un cromógeno, el p-nitrofenol, compuesto amarillo que, en solución alcalina, absorbe a una longitud de onda de 415 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la reacción (FIGURA 1) puede seguirse colorimétricamente.

Para detener la reacción se añadirá NaOH, ya que un pH demasiado alcalino desnaturaliza la proteína y, por ende, inhibe la actividad enzimática.

FIGURA 1. Hidrólisis de p-nitrofenilfosfato. Esta reacción enzimática produce p-nitrofenol, que presenta un máximo de absorción a λ = 415 nm.

1. CURVA PATRÓN DE P-NITROFENOL

Se rotularon siete tubos de ensayo (seis muestras más el blanco) y a cada uno se le agregó un volumen distinto de p-nitrofenol 2x10-4 M y de agua destilada (TABLA 1), además de 250 µL de buffer de glicina pH 10 y 750 µL de NaOH 0.25 M. Se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones.

TABLA 1. Curva patrón de p-nitrofenol. Se muestran los volúmenes de p-nitrofenol y agua agregados a cada tubo para la construcción de la curva patrón, así como los datos de absorbancia obtenidos a distintas concentraciones. Las mediciones se realizaron a λ = 415 nm.

REACTIVOS BLANCO 1 2 3 4 5 6

p-nitrofenol 2x10-4 M (L) 0 50 100 150 200 250 300

H2O (L) 500 450 400 350 300 250 200

ABSORBANCIA

=415 0.000 0.106 0.211 0.339 0.451 0.550 0.683

p-nitrofenol (mol) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

Se muestra a continuación la curva graficada con los datos obtenidos.

FIGURA 2. Curva patrón de p-nitrofenol. La ecuación de la recta se obtuvo a partir de la regresión lineal y resultó ser: y = 11.3464x – 0.0061 con r2 = 0.9989.

2. PROGRESO DE LA REACCION ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

Se rotularon seis tubos de ensayo y se les agregó 250 µL de p-nitrofenil-fosfato de sodio 2x10-3 M, 245 µL de agua destilada y 250 µL de buffer de glicina pH 10; tras lo cual se pre-incubaron aproximadamente dos minutos a 37 ºC antes de agregar 5 µL de fosfatasa alcalina en cada tubo (excepto en el blanco). Inmediatamente después de agregar la enzima, se comenzó a medir el tiempo de incubación, establecido para cada tubo, a 37 ºC (TABLA 2). Una vez transcurrido el tiempo se adicionaron 750 µL de NaOH 0.25 M para desnaturalizar la enzima y detener la reacción. Hasta este momento se agregaron 5 µL de enzima en el blanco para que la mezcla fuese análoga a la de los demás tubos. Finalmente, se realizó la lectura a λ = 415 nm, utilizando celdas de plástico para hacer las mediciones.

TABLA 2.- Progreso de la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina. Se muestra el procedimiento seguido para la construcción de la curva de progreso de la reacción enzimática (tubos 1-5) y los datos de absorbancia obtenidos a distintos tiempos. La última fila presenta los resultados obtenidos al utilizar la ecuación lineal para calcular la cantidad de producto de la reacción (p-nitrofenol) catalizada por enzima fosfatasa alcalina.

REACTIVOS BLANCO 1 2 3 4 5

Tiempo

(min) 5 5 10 15 20 30

ABSORBANCIA

=415 0.000 0.189 0.363 0.532 0.647 1.038

Cantidad p-nitrofenol (mol) 5.38x10-4 0.0172 0.0325 0.0474 0.0576 0.0920

La ecuación obtenida con la curva patrón permite calcular cantidad de p-nitrofenol en diferentes muestras a partir de la medición de absorbancia bajo distintas condiciones.

Por ejemplo, para el tubo 2, cuyo valor de absorbancia es 0.363:

Tomando la ecuación y = 11.3464x – 0.0061, sustituyendo el valor de absorbancia (Y) y despejando la cantidad de p-nitrofenol en µmol (X)

Cantidad de p-nitofenol (µmol)=(0.363-(-0.0061))/(11.3464 〖µmol〗^(-1) )=0.0325 µmol de p-nitrofenol

La actividad de una enzima se determina conociendo la velocidad de la reacción que cataliza. La velocidad de reacción se define como la cantidad de sustrato consumido o de producto formado por unidad de tiempo (Bárcena, s/a).

Conociendo la cantidad de p-nitrofenol y el tiempo al que se realizó la lectura es posible calcular la velocidad inicial (vi) de la reacción como la pendiente de la sección lineal de la curva de progreso de la reacción (FIGURA 3).

FIGURA 3. Progreso de la reacción enzimática de la fosfatasa alcalina. La pendiente de la recta es la vi de la reacción. La ecuación que se ajusta es y = 0.00298x + 0.00150 con r2 = 0.9964. De esta forma, vi = 0. 00298 µmol/min.

3. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

Se rotularon trece tubos de ensayo y a todos se les agregó 250 µL de p-nitrofenil-fosfato de sodio 2x10-3 M, 245 µL de agua destilada y 250 µL del buffer respectivo (TRIS, glicina o carbonatos); tras lo cual se pre-incubaron aproximadamente dos minutos a 37 ºC antes de agregar 5 µL de fosfatasa alcalina en cada tubo (excepto en los blancos). Inmediatamente después de agregar la enzima, se comenzó a medir el tiempo de incubación, que fue de cinco minutos a 37 ºC. Una vez transcurridos los cinco minutos se adicionaron 750 µL de NaOH 0.25 M para desnaturalizar la enzima y detener la reacción. Hasta este momento se agregaron 5 µL de enzima

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