Guía de laboratorio 2 Extracción de ADN genómico

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Guía de laboratorio  2  Extracción de ADN genómico

Introducción

El ADN (ácido desoxirribonucleico) es una estructura compuesta por una base nitrogenada, pentosa y un grupo fosfato, que contiene toda la información para el desarrollo, funcionamiento y supervivencia hereditaria de los seres vivos. Su modelo estructural fue dilucidado en 1953 por James Watson y Francis Crick y desde entonces el estudio del ADN ha generado grandes aportes en la investigación científica y medicina.

Basado en la elucidación en 1953 por James Watson y Francis Crick se describió que el ADN es una molécula compleja formada por dos hebras unidas por complementariedad de bases que se enrollan formando una estructura llamada doble hélice. Cada hebra, está constituida por una base nitrogenada de adenina, timina, citosina o guanina; un azúcar (desoxirribosa) y un grupo fosfato. Cada hélice formada se une a su complementaria a través de las bases nitrogenadas ligadas de forma específica, la adenina se une a la timina a través de dos puentes de hidrógeno y citocina se une a la guanina a través de tres puentes de hidrógeno (1).

Objetivo

Extraer y purificar ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico mediante kit de extracción

 Reactivos, materiales y equipos  

Procedimiento

Parte 1: LISIS DE LA MUESTRA

1. Tome 3 ml de cultivo en líquido, que contenga  1 x 10 4 - 5 x 10 6 células (la cantidad inicial típica es 1 x 106 células) y centrifuge a 1000 x g durante 1 minuto. Retire el sobrenadante y re suspenda en 100 µl de PBS frío pipeteando con cuidado hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces. Asegúrese de que el pellet se re suspenda por completo.

1. Agregue 1 µl de proteinasa K y 3 µl de RNasa A al sedimento resuspendido y mezcle mediante agitación breve para garantizar que las enzimas se dispersen de manera eficiente.

Nota: No agregue las enzimas y el tampón de lisis celular simultáneamente, ya que la alta viscosidad del lisado impedirá la distribución equitativa de las enzimas. La adición de RNasa A se puede omitir si un porcentaje bajo de ARN copurificado no afectará las aplicaciones posteriores. Para mayor comodidad al pipetear, las alícuotas de trabajo del stock de Proteinasa K se pueden diluir 5 veces. Determine cuánta proteinasa K necesita para sus preparaciones y mezcle esta cantidad de enzima con 4 volúmenes de agua libre de nucleasas o PBS. No utilice tampones que contengan EDTA como TE. Añadir 5 µl de esta dilución 5X a las células resuspendidas y proceder como se indica anteriormente.

1. Agregue 100 µl de tampón de lisis celular y agite inmediatamente y por completo. La solución rápidamente se volverá viscosa.
2. Incubar durante 5 minutos a 56°C en bloque calefactor y agite con el agitador una o dos veces durante la incubación. No es necesaria la incubación durante más de 5 minutos, pero no afectará negativamente la calidad del ADN purificado.

Parte 2: UNIÓN Y ELUCIÓN DEL ADN GENÓMICO

1. Agregue 400 µl de tampón de unión de ADN genómico a la muestra y mezcle bien mediante agitación vortex durante 5 a 10 segundos. Mezclar bien es esencial para obtener resultados óptimos.

1. Transfiera la mezcla de lisado/tampón de unión (~600 μl) a una columna de purificación de ADNg previamente insertada en un tubo de recolección, sin tocar el área superior de la columna. Continúe inmediatamente con el paso 3.

Nota: No vuelva a cargar la misma columna con más muestra; la sobreexposición de la matriz a la muestra lisada puede hacer que la membrana se expanda y se desprenda. Evite tocar el área superior de la columna con la mezcla de lisado/aglutinante y evite transferir la espuma que pueda haberse formado durante la lisis. Cualquier material que toque el área superior de la columna, incluida la espuma, puede provocar contaminación por sal en el eluato.

1. Cierre la tapa y centrifugue: primero durante 3 minutos a 1000 x  g  para unir el ADNg (no es necesario vaciar los tubos de recolección ni retirarlos de la centrífuga) y luego durante 1 minuto a velocidad máxima (> 12 000 x  g ) para limpiar la membrana. Deseche el flujo continuo y el tubo de recolección.

1. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y agregue 500 µl de tampón de lavado de ADNg. Cierre la tapa e invierta varias veces para que el tampón de lavado llegue a la tapa. Centrifugar inmediatamente durante 1 minuto a velocidad máxima (12.000 x  g ) y desechar el flujo.

1. Vuelva a insertar la columna en el tubo de recogida. Agregue 500 µl de tampón de lavado de ADNg y cierre la tapa. Centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a velocidad máxima (>12 000 x  g ), luego deseche el tubo de recolección y fluya.

1. Coloque la columna de purificación de ADNg en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sin ADNasa (no incluido). Agregue 35-100 µl de tampón de elución de ADNg precalentado (60 °C), cierre la tapa e incube a temperatura ambiente durante 1 minuto.

1. Centrifugar durante 1 minuto a velocidad máxima (> 12.000 x  g ) para eluir el ADNg

Entregables

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