Identificación De Los Genes Específicos

Identificación de los genes específicos

Después de la tecnología del ADN recombinante, los/as científicos/as se vieron en la necesidad de identificar las moléculas específicas del ADN.

Esa identificación permitió el desarrollo de nuevas técnicas y procedimientos así como el perfeccionamiento de las ya existentes y sus aplicaciones.

En las siguientes secciones se describen los diversos procedimientos que se utilizan para identificar los diferentes genes de los organismos.

Técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

La reacción en cadenas de la polimerasa, cuyas iniaciales en inglés son PCR (polimerase Chain Reaction fue desarrollada por Kary Mullis a mediados de los años 80, lo que le representó el premio Nobel en 1993.

Esta técnica que realiza millones de copias de ADN, ha revolucionado la biología moderna y se ha convertido en un procedimiento estándar para cualquiera que esté estudiando ADN. Con el PCR, secuencias específicas de pequeñas cantidades de muestras de ADN, pueden ser amplificadas para realizar pruebas y análisis.

Como su nombre lo indica, se basa en las actividades de la enzima ADN polimerasa, que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente.

Los requisitos necesarios para desarrollar esta técnica son:

• La enzima ADN polimerasa

• Presencia de nucleótidos en el medio (adenina, guanina, citosina y timina).

• Existencia de cebadores (primeros o iniciadores) que constituyen pequeñas cadenas de ADN.

 Desarrollo de la reacción en cadenas de la polimerasa

Esta reacción se desarrolla en tres etapas que son:

ETAPA 1.

Desnaturalización del ADN.

Se aplica calor a 95º C – 98ºC y las cadenas de la hélice de ADN se desarrollan y se separan.

Al romperse los enlaces de los átomos de hidrógeno, cada cadena, actuará como plantillas para la formación de nuevas moléculas.

ETAPA 2.

Adicción de cebadores.

Se disminuye la temperatura a 52º C – 60ºC para que los cebadores o iniciadores que se agregan, reconozcan sus secuencias complementarias, en las cadenas de ADN correspondientes y se unan a ellas.

Los cebadores son complementarios entre sí y corresponden a los extremos del fragmento del ADN que se desea ampliar.

ETAPA3.

Síntesis de las cadenas complementarias

Se eleva la temperatura de 72ºC a 75º C para que la enzima Taq polimerasa construya con nucleótidos presentes, una cadena complementaria de cada segmento amplificado, obteniendo nuevamente, moléculas de ADN de doble cadena.

En cada ciclo que se repite, se duplica todo el ADN presente en la reacción, de manera que en unas pocas horas, se obtienen más de mil millones de copias de un solo fragmento.

Al inicio del desarrollo de la técnica, los(as) científicos(as) utilizaron lo polimerasa I de E. Coli, cuyo proceso era lento y tedioso, porque esta enzima perdía actividad y era preciso añadirla de nuevo en cada ciclo.

Este problema se resolvió cuando se descubrió la bacteria Thermus aquaticus, que vive en las aguas termales y cuya polimerasa (Taq polimerasa) es capaz de trabajar a temperaturas de 70ºC. de esta manera sólo se necesita añadir la enzima al inicio de la reacción y llevar a cabo los ciclos que se desee.

¿Presenta esta técnica alguna limitación?

La limitación que presenta la técnica PCR, es que como el poder de la amplificación de la enzima es tan alto, los más pequeños contaminantes pueden dar falsos positivos, por lo que el material y las soluciones a emplear deben ser minuciosamente controlados.

 Aplicaciones de la técnica PCR

La PCR se aplicó inicialmente como una técnica de laboratorio de investigación, pero su gran especificidad y sensibilidad, ha permitido el desarrollo de técnicas específicas que se utilizan en muchos campos de investigación y análisis como los que explicaremos a continuación:

Investigaciones Genéticas:

• Clonación de genes.

• Detección de clones recombinantes.

• Estudio de ADN de fósiles.

Medicina:

• Exploración de enfermedades genética (anemia falciforme, fibrosis quística, y el síndrome del cromosoma X frágil).

• Diagnóstico prenatal (creación de mapas genéticos y detección de esperma aneuploide).

• Detección del reordenamiento de tumores cancerosos (tiene una sensibilidad alta, para detectar una sola célula tumoral entre un millón de células sanas).

• Detección de hormonas ectópicas.

• Permite determinar la compatibilidad genética en casos de trasplante renal.

Microbiología e infectología:

• Identificar el ADN de parásitos, virus y bacterias.

• Detectar la presencia de agentes infecciosos de lento crecimiento (herpes virus, virus de la hepatitis C, virus del SIDA, mycobacteriun, chlamydia y bacteria de la tuberculosis).

Medicina forense y criminalística:

• Determinación de paternidad y maternidad.

• Identificación de individuos sospechosos de participar en un crimen.

• Análisis de evidencias en caso de asesinato y violación.

Sanidad animal y mejora genética:

• Detección de enfermedades genéticas e infecciosas.

• Pureza de razas.

• Mayor producción de carne y leche.

Técnica de electroforesis en gel

Esta técnica permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño, cuando se aplica una corriente eléctrica a un gel (placa de agar), en cuyo interior se ha colocado la mezcla de fragmentos (obtenidos por métodos anteriores). Una vez aplicada la corriente, los fragmentos de ADN comienzan a moverse desde el polo positivo (debido al grupo fosfato, que tiene carga negativa).

Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas minores se mueven más rápido a través de los poros del gel que las de mayor tamaño.

Como resultado se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño, adaptando apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado.

Adicionalmente puede utilizarse una secuencia complementaria de un ADN como sonda para buscar un fragmento específico en el patrón de banda.

...