LABORATORIO DE CINETICA ENZIMATICA

LABORATORIO DE CINETICA ENZIMATICA

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN 3

OBJETIVOS 4

General 4

Específicos 4

MARCO TEÓRICO 5

METODOLOGÍA 9

Materiales 9

Procedimiento 12

Flujogramas 13

RESULTADOS 16

Protocolo 1 (Sin inhibidor) 16

Protocolo 2 (Con inhibidor) 16

Protocolo 1 (Sin inhibidor) tomando el estándar del protocolo 2 (Con inhibidor) 18

pH y temperatura 20

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN 22

CONCLUSIONES 25

BIBLIOGRAFÍA 26

ANEXOS 27

Protocolo 1 (Sin inhibidor): 27

Protocolo 2 (Con inhibidor): 30

Protocolo 1 (Sin inhibidor) tomando el estándar del protocolo 2 (Con inhibidor) 34

pH y temperatura 34

Según grafica 2 35

Según grafica 3 37

Fichas de seguridad 38

¬¬INTRODUCCIÓN

El funcionamiento de las enzimas como catalizadores biológicos que permiten la interacción apropiada de las reacciones en nuestro cuerpo por medio de la aceleración de funciones que mantiene un estado de continuidad ideal capaz de regular los flujos energéticos en los sistemas acoplados, se ve condicionado por factores dentro del organismo que regulan el área de acción y permiten la identificación adecuada del sustrato según la necesidad específica de los mecanismos; estos parámetros que modifican la actividad enzimática inciden en las reacciones como variables físicas cuyo cambio no altera la estructura química del producto, más si la capacidad de trabajo correspondiente; considerándose un fundamento a favor de la complejización de la vida al conseguir eficiencia en la reproducción de funciones vitales y coordinar organismos multisistémicos.

El análisis cinemático de la actividad enzimática puede partir de la evaluación de la reacción determinada por las variaciones de los parámetros que inciden en la velocidad; permitiendo la comprensión de elementos fundamentales para mantener un adecuado desarrollo de los procesos y la manera en que estos determinarán el balance del sistema.

La evaluación de la actividad enzimática a partir de su comportamiento cinemático, realizada durante la práctica que corresponde al registro de la velocidad de la Fosfatasa (presente en hígado de res) comparada por la diferencia en concentración de sustrato (PNFP); se efectuará bajo el análisis espectrofotométrico de la concentración de producto (PNF) resultante en un mismo periodo de tiempo en reacción de las diluciones; la cual será determinada en función del patrón entre su densidad óptica respecto a una longitud de onda de 405nm y su concentración (Ley de Lambert-Beer). Se ilustran las gráficas de Michaelis- Menten y Lineweaver-Burk las cuales permiten comparar la velocidad de la reacción con la cantidad de sustrato disponible.

El estudio de estos datos, además de los suministrados por la evaluación del efecto inhibidor, y las alteraciones por temperatura y pH, mediarán el comportamiento de la enzima y las condiciones necesarias para que el proceso resulte efectivo.

OBJETIVOS

General

Analizar cómo se efectúa la cinética enzimática a partir de la acción de la Fosfatasa como catalizador del sustrato PNFP (obtenida del extracto de hígado de res), en reconocimiento de los parámetros que afectan la velocidad de la reacción.

Específicos

Calcular el Km para la fosfatasa (enzima) y la constante de disociación (Ki) del inhibidor (fosfato inorgánico).

Establecer la concentración del producto a partir de los datos tomados del espectrofotómetro utilizando la relación de Lambert-beer.

Determinar cómo se modifica de la velocidad de la reacción enzimática cuando varían las concentraciones de sustrato.

Evaluar cómo se desarrolla el efecto del inhibidor en la reacción enzimática y que tipo de competencia representa para la formación del complejo activo y velocidad máxima alcanzada.

Relacionar la velocidad de la reacción con la concentración del producto.

Evaluar el comportamiento de la enzima a diferentes pH y temperaturas.

MARCO TEÓRICO

Las enzimas son proteínas formadas por todas las células de los diversos organismos, específicamente son proteínas globulares, es decir, tiene formas esféricas. Su principal característica es que son moléculas que van acelerar de forma muy selectiva y eficiente la velocidad de las reacciones del metabolismo en las cuales participan, es decir, son biocatalizadores, esto lo hacen disminuyendo la energía que requiere la reacción para poder ser realizar, denominada energía de activación. Así, según el tipo de reacciones que catalicen las enzimas pueden clasificarse en varios grupos: oxidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas

Figura 1

https://goo.gl/DM5oyf

*Biocatalizadores.

Toda enzima actúa sobre una molécula en particular sobre la cual va hacer muy específica, esa molécula se denomina sustrato. el sustrato va hacer convertido en un producto de interés, mientras que la misma enzima no va a sufrir ningún cambio durante la reacción en la cual participa.

La reacción enzimática general de transformación de un sustrato específico en un producto se puede representar con la siguiente ecuación:

Figura 2

https://goo.gl/qoiKWg

Las enzimas deben estar unidas a otras moléculas para poder funcionar de una manera más eficiente, es decir, para ser activas. Así por ejemplo solo la parte proteíca o la fracción proteíca de la enzima es denominada apoenzima y es catalíticamente inactivo; mientras que la parte no proteína se denomina cofactor, que pueden ser pequeñas moléculas de naturaleza orgánica o inorgánica que la apoenzima va a necesitar para ser activa; este último es muy similar a los grupos prostéticos con la diferencia de que estos están unidos a la enzima más fuertemente. Finalmente se va a denominar holoenzima a la encima activa y esa encima activa va estar formada por la apoenzima, el cofactor o grupo protético para que la enzima funcione de una manera más eficiente.

Figura 3

https://goo.gl/MoqMJa

*algunas enzimas necesitan una porción no proteica para desempeñar su función.

Realizar ensayos en el laboratorio en diferentes condiciones experimentales para estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por

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