La verdadera depredación de los patógenos orales por Bdellovibrio bacteriovorus 109J.

La depredación de los patógenos orales por Bdellovibrio bacteriovorus 109J

RESUMEN

Las enfermedades periodontales son infecciones multifactoriales provocadas por un complejo de bacterias principalmente gram-negativas que interaccionan con los tejidos del huésped y conducen a la destrucción de las estructuras periodontales. Bdellovibrio bacteriovorus es una bacteria gram-negativa que se aprovecha de otras bacterias gram-negativas. Fue demostrado previamente que B. bacteriovorus tiene una capacidad para atacar y eliminar a las bacterias pegadas a superficie o biofilm. En este estudio, hemos examinado a la zona anfitriona específica de B. bacteriovorus 109J cepa y su capacidad para aprovecharse de los patógenos orales asociados con la periodontitis, incluyendo; Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis y forsythia Tannerella. Además, demostramos que B. bacteriovorus 109J tiene una capacidad de eliminar biofilms de Ei. Corrodens, así como biofilms compuestos de A. actinomycetemcomitans. Bdellovibrio bacteriovorus fue capaz de eliminar A. actinomycetemcomitans desarrollados en superficies de hidroxiapatita y en presencia de saliva, así como tambien separar metabólicamente los biofilms inactivos. Los experimentos dirigidos en mejorar la aptitud eliminadora de biofilm de B. bacteriovorus con la ayuda de enzimas degradadoras de sustancias polimericas extracelulares demostramos que la proteinasa-K inhibe la depredación. Sin embargo, el tratamiento del biofilm de A. actinomycetemcomitans con DspB, una enzima hidrolisadora de poli-N-acetilglucosamina (PGA), aumentó la eliminación de biofilm. El aumento de la eliminación de biofilm fue también grabado cuando A. actinomycetemcomitans mutantes PGA-defectuosos se utilizaron como células huésped, lo que sugiere que la degradación de PGA podría mejorar la eliminación de biofilm de A. actinomycetemcomitans por B. bacteriovorus.

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades periodontales son infecciones multifactoriales provocadas por un complejo de especies de bacterias que interactúan con los tejidos del huésped y dan lugar a la destrucción de las estructuras periodontales, incluyendo los tejidos de soporte del diente, hueso alveolar y el ligamento periodontal. La enfermedad periodontal es una significante problema de salud pública mundial y es probablemente la enfermedad infecciosa crónica más común en los seres humanos. Sólo en los Estados Unidos, más del 70% de la población es infligido con la enfermedad, con aproximadamente el 54% de todos los adultos estadounidenses de 30 años o más que sufren de alguna forma de enfermedad periodontal (Albandar y Kingman, 1999). La importancia de las bacterias en la placa dental y el papel clave de la placa en la etiología de la enfermedad periodontal está bien establecida. Mientras que las bacterias orales colonizan y producen la enfermedad principalmente en la cavidad oral, sino que también puede producir enfermedad sistémica (Scannapieco, 1998;. Garcia et al, 2001). Por lo tanto, la mitigación de la infección oral es de amplia importancia clínica más allá de los límites de la cavidad oral. Entre las bacterias con frecuencia aisladas de las bolsas periodontales son las bacterias gram-negativas Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis y forsythia Tannerella, todos los cuales están fuertemente asociadas con diversas formas de periodontitis incluyendo periodontitis agresiva localizada, generalizada temprana periodontitis inicio y la periodontitis crónica (Dzink et al, 1985;. Wilson et al, 1991;.. Bolstad et al, 1996; Tanner y Izard, 2006;. Fine et al, 2007). Además de su papel en la enfermedad periodontal, la presencia de estas bacterias también estaba implicado como un agente causante de varias infecciones no orales (Kaplan et al, 1989;. Beck et al, 1996;. Offenbacher et al, 1996;. Dibart et al, 1998;. Takamatsu et al., 1999; Roberts, 2000;. Chang et al., 2004, Hombach et al, 2007;. Miller et al, 2007;. Kajiya et al, 2008). La dificultad para eliminar la placa o biofilms orales por las terapias convencionales condujo a los investigadores a examinar otros métodos alternativos para el control del biofilm, tales como agentes de control biológico. Un agente biológico que pueda ser usado para controlar las bacterias patógenas son las procariotas depredadores del género Bdellovibrio. Bdellovibrio son bacterias gram-negativas que se alimentan de otras bacterias gram-negativas (Stolp y Starr, 1963; Sockett, 2009). Recientemente, se demostró que B. bacteriovorus 109J puede reducir significativamente biofilms desarrollados en un ensayo estático basado en placa de microtitulación, así como en un sistema de células de flujo (Kadouri & O'Toole, 2005;. Núñez et al, 2005; Medina et al ., 2008). Bdellovibrio bacteriovorus cepa HD100 también ha demostrado ser capaz de atacar y matar a cuatro cepas lisas y una biofilm-cepa que forma aproximada de A. actinomycetemcomitans (Van Essche et al., 2009). En este estudio, la sensibilidad de los patógenos orales a la depredación por B. bacteriovorus 109J fue examinado en suspensión líquida y en biofilms. La capacidad depredadora de B. bacteriovorus también se evaluó en diferentes condiciones de crecimiento clínicamente relevantes. Por último, se hizo un intento para mejorar la aptitud eliminación de B. bacteriovorus con el uso de otras enzimas biofilm-degradantes.

MÉTODOS

Cepas bacterianas, medios y condiciones de crecimiento

Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Actinobacillus Aggregatibacter se cultivó de forma rutinaria en infusión de cerebro y corazón (BHI) y la IE. Corrodens se hizo crecer en placas de caldo de soja tríptico (TSB) de agar sangre (5% de sangre de oveja desfibrilada y 1,5% de agar) o en TSB que contienen 2 mg ml) 1 KNO3 y 5 lg ml) 1 hemina. El F. nucleatum se cultivó en placas de agar sangre TSB; Pr. intermedia, Po. gingivalis y T. forsythia se cultivaron en placas de agar de sangre TSB suplementado con 5 lg ml) 1 hemina y 1 lg ml) 1 menadiona. Se añadió ácido N-acetilmurámico (0,001%) a las placas de forsythia T.. Tanto A. actinomycetemcomitans y Ei. corrodens se cultivaron a 37 ° C en CO2 al 10%, mientras que F. nucleatum, Pr. intermedia, Po. gingivalis y T. forsythia se cultivaron en condiciones anaerobias (10% CO2, 10% de H2 y 80% de N2) en un MACS MG 250 cámara anaeróbica (Microbiología Internacional, Frederic, MD) a 37? C. El B. bacteriovorus se mantuvo en forma de placas en caldo nutriente diluida de doble capa [DNB; 0,8 g l) 1 caldo nutriente modificado con MgCl2Æ6H2O 3 mM y CaCl2Æ2H2O 2 mM (pH 7,2)] agar (0,6% de agar en la capa superior) (Starr, 1975). Para iniciar un lisado, los co-cultibos de B. bacteriovorus se obtuvieron mediante la adición de un tapón de agar que contiene B. bacteriovorus placa a 1 · 10^8 unidades formadoras de colonias (CFU) ml) 1 de Escherichia coli lavada presa en DNB, y se incubaron a 30*C en un conjunto agitador rotatorio a 200 rpm hasta que el co-cultivo se hizo evidente (Stock lisado). Para cosechar B. bacteriovorus, se prepararon co-cultivos en los cuales 2 ml de células huésped de E. coli lavada y cultivada durante la noche (1 · 10^9 UFC ml-1) fueron incubadas con 2 ml de reservorio lisado en 20 ml de DNB. Los co-cultivos se incubaron durante 18 h para alcanzar una concentración final de aproximadamente 1 · 108-unidades formadoras de placa ml) 1 de depredador. En este punto se pasó el lisado tres veces a través de un 0,45 lm Millex de tamaño de poro de filtro (Millipore, Billerica, MA) para eliminar la presa residual y los restos celulares (lisado filtrado). Como control, el lisado filtrado esterilizado se preparó pasando secuencialmente el cultivo deB. bacteriovorus a través de tres filtros tamaño de poro de 0,22-LM. Después de la filtración, ningún depredador, juzgado por la formacion de unidades formadoras de placas, se pudo detectar (Kadouri & O'Toole, 2005).

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