Mitocondria
YeZii718 de Septiembre de 2012
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Transición de permeabilidad mitocondrial como
inducida por
la reticulación de la adenina nucleótido
translocasa
Cecilia Zazueta, Horacio Reyes-Vivas,
Gabriela Zafra, Ce? Sar A. Sa? Sánchez,
Gabriela Vera, Edmundo Cha? Chávez *
Departamento de Bioqu?? Mica, Instituto
Nacional de CardioLog? A, Ignacio Cha? Chávez,
Juan Badiano No. 1, 014080 México, D.F.,
México
Recibido el 6 de mayo de 1997, aceptado 09 de diciembre 1997
Abstracto
Transición de permeabilidad mitocondrial es
causado por la apertura de un poro transmembrana
química cuya naturaleza
no ha sido bien establecida. La
presente trabajo tuvo como objetivo contribuir en mayor medida
al conocimiento de la
membrana entidad compuesta en la formación de
la falta de especificidad? c canal. El aumento de
permeabilidad se estableció
mediante el análisis de la incapacidad del riñón de rata
mitocondrias de absorber y acumular Ca2 +,
así como su falta de
construir un potencial transmembrana, después de la
la reticulación de proteínas de la membrana por el cobre
más orto-
fenantrolina. Para identificar el reticulado
proteínas, electroforesis en gel de poliacrilamida
Se llevó a cabo. Los resultados
son representativos de al menos tres separado
experimentos. Se indica que 30 mM Cu2 +
induce la liberación de
4,3 nmol Ca2 + por mg de proteína. Sin embargo, en la
presencia de 100 mM de orto-fenantrolina sólo
2 mM de Cu2 + fue
requerido para alcanzar la liberación total de la
acumulado Ca2 +, hay que señalar que
tal reacción no se inhibe
por ciclosporina. El aumento de la permeabilidad
corresponde a la reticulación de la membrana
proteínas en las cuales
aproximadamente 4 grupos tiol por nmol mg
proteínas parecen estar involucrados. Dicha vinculación
proceso es inhibido por
carboxyatractyloside. Mediante el uso de la uorescente?
sonda eosina-5-maleimida la etiqueta se encontró
en una reticulación
60 kDa dímero de dos monómeros de 30 kDa. Desde
datos presentados se concluye que el cobre? o-
fenantrolina
induce la reticulación intermolecular de
la translocasa de nucleótidos de adenina en la que
a su vez se convierte en no-
especi? c poro. # 1998 Elsevier Science Ltd.
Todos los derechos reservados.
Palabras clave: mitocondrias; transporte de calcio;
Proteína entrecruzamiento; nucleótido adenina
translocasa, la transición de permeabilidad; Mem-
branas grupos tiol;? Copper orto-
fenantrolina
1. Introducción
Transición de permeabilidad mitocondrial es
de? ned
como una permeabilidad no selectiva que permite
la
liberación de constituyentes de la matriz a través de un
trans-
membrana de canales con un diámetro de, al
al menos,
2,8 nm [22, 46]. La activación de esta
camino
requiere matriz de Ca2 + de carga, además de un
indu-
cing agente (para una revisión ver Refs. [16, 46]).
Entre
la amplia variedad de inductores, tiol-bloqueo
reactivos se han utilizado con éxito y
exten-
exclusivamente para promover la transición de permeabilidad.
Dentro
este contexto, han informado de que el
unión de
La Revista Internacional de Bioquímica y
Cell Biology 30 (1998) 517? 527
1357-2725/98 / $ 19,00 # 1998 Elsevier Science
Ltd. Todos los derechos reservados.
PII: S1357-2725 (97) 00157-X
La
Internacional
Journal of
Bioquímica
Y Biología Celular
PERGAMON
* Autor para correspondencia. Fax: +52-915-5730926;
e-mail:
echavez@cenids.ssa.gob.mx.
Hg2 +, principalmente de las proteínas de membrana con
molecu-
lar masas de entre 20 y 30 kDa, su? ces a
inducir la liberación de Ca2 + y el colapso de la
transmembrana-
brana eléctrico gradiente [6]. Además,
Petronilli
et al. [37] han discutido que la titulación de
crítico
tioles vecinales de residuos de cisteína con
sulfhidrilo
reactivos tales como menadiona, diamida, arsenito
y terc-butilo, coinciden con
la
la apertura de un megachannel mitocondrial. Sum-
marizing, química modi? catión de tiol
grupos
induce una permeabilidad generalizada.
Además,
Novgorodov et al. [32] y Valle et al. [45]
tener
demostrado que la activación de la no-selectiva
trans-
puerto también se produce a través de la formación de
sulfhy-
dryl puentes entre las proteínas de membrana. La
mecanismo que subyace a este último proceso podría
ser
adscritos al Con? gurational de algunos cambios
proteínas de la membrana. Sobre la base de que ADP
suprime no especi? c permeabilidad y el automóvil
boxyatractyloside lo activa, varios
autores pos-
Tulate la translocasa de nucleótidos de adenina como
un
poro de la membrana que permite que el potencial
liberar
de contenido de matriz [3, 11, 17, 26, 33].
Sin embargo, la
constituyentes de la hidrófilo no especificados? c
canal no ha sido bien establecida.
Los resultados experimentales presentados en esta
trabajo indican que el cobre? orto-
fenantrolina
induce la reticulación de proteínas de la membrana
con
pesos moleculares de aproximadamente 30 kDa;
coches
boxyatractyloside inhibe esta reacción.
Como
cationes resultado de tales modi?, acumulado Ca2 +
se libera y la interna negativa
membrana
colapsos potenciales. Mediante el uso de la uorescente?
sonda eosina-5-maleimida, la etiqueta se encontró
en un reticulado de 60 kDa dímero de dos 30
monómeros.
2. Materiales y métodos
Las mitocondrias de la corteza de riñón de rata
Se prepararon en 0,25 M de sacarosa ± 1 mM EDTA
siguiendo los procedimientos estándar de centrifugación-
gación. El pellet mitocondrial ® nal fue sus-
suspendida en medio de sacarosa sin EDTA. Proteína
se determinó según Lowry et al. [27].
El portador de ADP / ATP fue aislado esencialmente como se
descrito por Riccio et al. [38] como sigue: 16 mg
proteína de partículas submitocondriales eran
solubilizado por incubación durante 10 min a 48C,
con Triton X-100 en 0,5 mM de EDTA y 10 mM
MOPS, pH 7,2. La mezcla solubilizada fue
incubaron con hidroxilapatita (2 mg / ml hidro-
xylapatite), equilibrada con 10 mM MOPS,
0,1 M NaCl, 0,05 mM EDTA y 0,5% de Triton
X-100, pH 7,2 mediante la técnica de proceso por lotes para
30 min a 48C. La fracción no unida fue col-
seleccionado mediante centrifugación y se trató durante una noche
con 5 volúmenes de acetona fría a ÿ208C. La
precipitado resultante se recogió por centrifugación-
ción y se secó bajo un ow ¯ N2. Cross-linking
proteínas de membrana se realizó por el ad-
condición de cobre 2 mM y 100 mM de orto-fenantreno-
throline (Cu ± op). Transporte de calcio era
determinada por la incubación de las mitocondrias
en presencia de 50 mM 45CaCl2 acto (sp..
1000 cpm / nmol). Después de la incubación, la reacción
se detuvo mediante ® ltrado 0,2 ml de la suspensión
a través de un ltro Millipore ® de 0,45 mm de diámetro de poro-
eternos. En el transporte alternativo calcio experimentos
se midió espectrofotométricamente a 675 ±
685 nm, mediante el uso de Arsenazo III [39]. Los cambios en la
el potencial transmembrana se siguieron utilizando
la safranina colorante, en una viga en doble espectrofotómetro
Tometer a 511 ± 533 nm [1]. Etiquetado fluorescente
proteínas de membrana se llevó a cabo por el en-
cubation de las mitocondrias en la presencia de
20 nmol por mg de proteína de eosina-5-maleimida
(EMA), de acuerdo con Majima et al. [28].
Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
de las proteínas mitocondriales, se llevó a cabo en la
presencia de sulfato de sodio 2% de dodecil y 12%
poliacrilamida en geles de losa. Membrana tiol
grupos se determinaron con reactivo de Ellman,
5,5 '-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB), en
412 nm como se ha descrito previamente [13]. Incubación
medios de comunicación y otras condiciones experimentales fueron
describe en las leyendas de la correspondiente
® guras. Los resultados son representativos de, al menos,
tres di € experimentos erent.
3. Resultados
En un informe anterior, Harris y Baum [19]
demostrado que el cobre aumentó mito-
518 Zazueta C. et al. / La Revista Internacional de Bioquímica y Biología Celular 30 (1998) 517 ± 527
conductancia de la membrana drial a Ca2 +. En acuerdos
ambiente, la fig. 1A muestra Ca2 + inducida por e.ux
aumento de las concentraciones
...