OBSERVACIÓN DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

PRÁCTICA 1. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE

leucocitos desempeñan una función importante en la respuesta inmunológica; estos se clasifican según su morfología en dos grandes grupos, los granulocitos y los agranulocitos. Ambos grupos se subdividen de acuerdo a sus características morfológicas y de tinción; así los granulocitos están formados por los neutrófilos, basófilos y eosinófilos, de igual modo los agranulocitos contienen a los linfocitos y monocitos.

El estudio de las células blancas mediante la observación microscópica de un frotis sanguíneo se denomina recuento diferencial y es una prueba útil en clínica; aunque el análisis se puede extender y complicar incluso hasta la identificación de características más definidas como son los antígenos de superficie.

1.2 OBJETIVO

Observar los diferentes glóbulos blancos presentes en sangre periférica de acuerdo a sus características morfológicas y de tinción.

1.4 PROCEDIMIENTO

1. Extraer 3.0 mL de sangre venosa, depositar en el tubo y mezclar o hacer la punción capilar con la lanceta; con esta sangre hacer un frotis colocando el portaobjetos para deslizar delante de la gota de sangre deslizándolo a un ángulo de 45° y dejar secar al aire. Una vez que el frotis ya esté seco, colocar sobre el puente de tinción y aplicar el colorante hasta que se cubra por completo el portaobjetos y dejar reposar por un minuto.

2. Agregar suavemente el amortiguador en la misma cantidad que el colorante homogeneizando ambos reactivos. Evitar que la mezcla de colorante-amortiguador se derrame del portaobjetos. Dejar reposar de 3 a 6 minutos.

3. Lavar con abundante agua destilada hasta que deje de escurrir colorante. El colorante que puede adherirse al reverso del portaobjetos se elimina con una gasa o torunda alcoholada.

4. Dejar secar el frotis al aire y finalmente observar al microscopio buscando el campo con el objetivo 10X y posteriormente realizar el conteo con el objetivo de 100X colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

PRÁCTICA 2. REACCIONES DE AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN

La reacción de aglutinación es una reacción antígeno-anticuerpo secundaria que resulta de la unión de los anticuerpos aglutinantes con sus antígenos particulados que forman grumos visibles al menos bajo el microscopio óptico.

Otra de las reacciones antígeno-anticuerpo secundarias, es la reacción de precipitación, consecuencia de la formación de redes entre un antígeno soluble y su anticuerpo específico y la forma más simple y directa para demostrar las reacciones antígeno anticuerpo en el laboratorio.

Estas reacciones, como todas las reacciones inmunológicas, dependen del pH del medio, la temperatura, la presencia de amortiguadores de pH y de las concentraciones relativas de los dos reactantes.

PROCEDIMIENTO

Determinación del grupo sanguíneo

1. Separar por centrifugación el plasma y el paquete globular; posteriormente lavar el paquete globular dos veces con solución salina isotónica. Luego, preparar una suspensión de eritrocitos al 2% en solución salina isotónica.

2. Marcar tres tubos de ensaye pequeños con las letras A, B y O. En cada uno de ellos, poner una gota de una suspensión globular al 2 % y posteriormente el antisuero correspondiente: anti A, anti B. anti AB; se incuba tres minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante 30 segundos. Observar la aglutinación.

Determinación de factor Rh

1. Preparar dos tubos y rotular como problema y control, colocar una gota de suspensión de eritrocitos problema al 2% y añadir una gota de suero anti D en ambos tubos.

Anadir una gota del suero de Coombs en el tubo control. Finalmente, incubar los tubos a 37ºC durante tres minutos, terminado este tiempo, centrifugar a 1500 r.p.m. durante 30 segundos, por ultimo observar aglutinación.

Precipitación en capilar

1. Preparar una serie de diluciones dobles de suero anti IgG humana y de suero anti suero humano en solución salina isotónica. Preparar 1.0 mL de solución antigénica (IgG humana), con una concentración de 1.0 mg mL-1. En el caso del suero humano normal, emplear directamente sin diluir.

2. Dividir un capilar en 4 partes iguales. Llenar por un extremo del capilar con solución de antígeno (IgG humana o suero humano normal).

3. Limpiar el exterior del capilar y por inversión pasar su contenido al otro extremo.

4. Cuidar de no dejar salir el antígeno, ni permitir la formación de burbujas, tomar por capilaridad la dilución correspondiente de antisuero hasta llenar otra cuarta parte del capilar.

5. Limpiar el exterior y llevar el contenido a la parte central del mismo. Se coloca sobre plastilina en forma vertical de manera que el anticuerpo quede en la parte superior.

6. Incubar 10 a 15 minutos a temperatura ambiente y observar el precipitado formado. observar la zona de equivalencia y el título del antisuero. Si se quiere, se puede sellar el capilar y centrifugar en microcentrífuga y medir el precipitado sedimentado.

Doble inmunodifusión (Ouchterlony)

1. Preparar 80mL de una solución de agarosa al 1% en PBS pH 7.2-7.4 y agregar merthiolate a una concentración final de 0.1%.

2. Vaciar en dos cajas de Petri y dejar gelificar. Hacer a cada caja horadaciones de 2.5 mm de diámetro en el agar de acuerdo al número

8

de antígenos a probar alrededor de un pozo central para el antisuero de prueba.

3. Agregar en el pozo central 20 μL del antisuero de prueba y en los pozos restantes 20 μL de los antígenos a probar.

4. Incubar a temperatura ambiente por 24-48 h y observar las bandas de precipitación.

PRÁCTICA 3. ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO

El sistema de complemento es una vía efectora importante de la respuesta inmune humoral no específica del organismo humano, consiste de múltiples proteínas séricas presentes en la sangre en forma inactiva que interactúan secuencialmente.

El complemento reacciona tipo cascada que origina una amplificación de la reacción y una simple fase efectora. Esta cascada consiste en cuatro segmentos: dos vías de reconocimiento, uno de activación (la clásica y la alterna), una reacción común de amplificación y una sola fase efectora.

Como toda respuesta inmunológica, los efectos benéficos de la vía del complemento pueden convertirse en adversos y peligrosos dependiendo del sitio donde se ejerzan y la duración de la activación del complemento.

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