PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE

PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE

A, CASTILLO1. L, GUERRERO1. V, ARRIETA1. F ROMERO1

1. Estudiantes de biología  IV semestre  universidad de sucre

UNIVERSIDAD DE SUCRE

RESUMEN

El proceso de extracción del ADN,  sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas. Sin embargo cabe resaltar que en general los métodos de extracción de ADN consisten en la destrucción y lisis del material celular, seguido de una remoción de proteínas típicamente obtenida por digestión con proteinasa K, y la extracción del ADN usando altas concentraciones de sales, extracción orgánica o la unión del ADN a una fase sólida (intercambio iónico o técnica de silica). Existen varias técnicas que se utilizan para la extracción de ADN; en esta práctica se utilizó el método de altas concentraciones de sales con el fin de extraer material genético o ADN de la sangre periférica total de  humano.
Por otra parte tenemos que la electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos (ADN o ARN). Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA extraídas de la sangre periférica total de humano, para comprobar los resultados de la extracción se realizó una electroforesis en la cual se visualizaron las bandas de ADN corridas en el gel de agarosa, en donde los métodos utilizados resultaron ser viables para llevar a cumplir los objetivos propuestos.

PALABRAS CLAVES

Extracción de AND, método salino, purificación, electroforesis.

INTRODUCCIÓN

La molécula de ADN es una larga doble hélice enrollada sobre sí misma, semejante a una escalera de caracol y se unen por puentes de hidrogeno. En ella, dos ramales compuestos de moléculas de azúcar (desoxirribosa) y fosfatos, se conectan gracias al  apareamiento de cuatro moléculas denominadas bases, las cuales forman los eslabones de la escalera. Estas cadenas formadas por cuatro nucleótidos distintos, compuestos además por un azúcar (la desoxirribosa), un ácido fosfórica,  y una de las siguientes bases nitrogenadas: adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T).

Los diferentes métodos de extracción de

ADN de células sanguíneas reportados varían ampliamente. Estos métodos se basan, en su mayoría, en el uso de solventes orgánicos tóxicos, como fenol/ cloroformo para la separación de ácido nucleico de las proteínas y demás componentes celulares1.

Desde hace dos décadas se han reportado otros métodos que eliminan proteínas y contaminantes celulares, empleando una alta concentración de sales tales como acetato de potasio, con resultados similares, sin la toxicidad de solventes orgánicos.

Uno de estos métodos fue reportado por Miller en 19882 y es conocido con el nombre de purificación salina o salting out. El ADN se aísla mediante precipitación en presencia de alcohol isopropanol o etanol y se disuelve en agua o en una solución tamponada que puede contener conservantes del ADN, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)3. El ADN es normalmente aislado de la capa leucocitaria o las muestras de linfocitos, los cuales se obtienen por purificación previa por centrifugación o filtración en gradientes de densidad.

Este método es sencillo, a partir de poco volumen de sangre, y que permite obtener un ADN genómico con concentración adecuada, alto peso molecular y de buena calidad, con el menor número de contaminantes, buscando así reducir los efectos de  inhibición o disminución de la sensibilidad y la eficiencia de la amplificación de las secuencias del ADN.

METODOLOGÍA

Se utilizó una micropipeta que transfirió un volumen de 500ul de sangre periférica a un microtubo de 1.5 ml, se centrifugo a 12000 rpm por 5 min a 4°C.

• 500ul de sangre periférica

[pic 1]

• Centrifugación a 12000rpm

[pic 2]

Al pellet obtenido se le agregaron 500ul de buffer de extracción (tris 10mM, EDTA 1Mm SDS 1%) y se homogenizo teniendo cuidado de que no se formaran burbujas, luego se centrifugo nuevamente a 12000 rpm por 5 min a  4 °C. al pellet obtenido se le adiciono 500 uL de buffer de extracción (tris 10mM, EDTA 1Mm SDS 1%) y se homogenizo teniendo cuidado de no formar burbujas.

Se adiciono 2.5ul de proteinasa k y se incubo durante 30 min en baño de maría a 55°C.

• Baño de maría

[pic 3]

Luego se inactivo la proteinasa k por ebullición durante 15 min a 95°C.

Posteriormente se centrifugo la muestra a 12000 rpm durante 10min a 4°C y se le adiciono al sobrenadante 500 uL de potasio a 5M; se mezcló por inversión  e incubo en hielo por especio de 15min.

• Incubación con hielo

[pic 4]

Después de centrifugar a 12000 rpm por 10 min se adiciono al sobrenadante 0.6 volúmenes de isopropil frio, y se incubo la muestra durante 15 min  a -76°C. Seguidamente se centrifuga a 12000rpm durante 10 min, para descartar el isopropanol se lavó el pellet de AND dos veces con 1 ml de etanol  al 70 %. Nuevamente se centrifugo a 12000 rpm durante 5 min y se descartó el etanol, luego se dejó secar el pellet en el concentrador de AND  a 55°C durante unos 20 a 30 min y finalmente se suspendió la muestra a 50 uL de agua destilada estéril.

• Residuo de ADN luego de todos los procedimiento

[pic 5]

Se tomó una muestra del residuo obtenido y se coloca en el nanodrop donde se observó la presencia de los diferentes compuestos que presentaba la muestra.

• Muestra en el nanodrop

[pic 6]

Para observa el estado cualitativo del ADN, se realizó  la electroforesis en cámara de gel con  agarosa para observar si hay o no presencia d ADN en la muestra tratada.

Se prepara la bandeja y se coloraron los peines, simultáneamente se pesó 2,5 gr. de agarosa y colocando la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de buffer TBE 0,5X y  se caliente en el blanca hasta su completa disolución. Cuando la solución de agarosa había  alcanzado una temperatura soportable,  se agregó  25 uL de SYBR Green se mezcló bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solución y se deposita en la bandeja hasta que estuvo con la consistencia apropiada para agregar en los espacios la muestra obtenida y poder confirmar los componentes y la presencia de ADN.

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