Práctica No. 1 “Aislamiento y caracterización de DNA”

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Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Microbiología
Genética Microbiana

Práctica No. 1

“Aislamiento y caracterización de DNA”

Grupo: 5QM2            Sección: 2  Equipo: 8

Profesores:

Ilse Citlalli Calvo Villarreal

María Virgen Garcia Rangel

César Ismael Ortiz Garcia

Margarita Pineda López

Integrantes:

Objetivos

• Aislar DNA cromosómico de la cepa de Escherichia coli W3350.
• Establecer el espectro de absorción y determinar el grado de pureza y la concentración del DNA de Escherichia coli W3350 aislado.
• Determinar influencia de la relación de la temperatura de fusión (Tm) del DNA.

Introducción

El ácido desoxirribonucleico (DNA) es una molécula muy larga que contiene miles de desoxirribonucleótidos de cuatro clases distintas, unidos en una secuencia que es característica para cada organismo.

El DNA es un polinucleótido de doble cadena, la estructura de soporte está formada por grupos fosfato y una pentosa que es la desoxirribosa. (Chávez, 2012) 

Se aislará y caracterizará DNA de Escherichia coli W3350, microorganismo Gram (-) por lo que se tendrán ciertas consideraciones al aplicar el método de aislamiento.

El fundamento del protocolo de Marmur y Kirby, en el cual se basa esta práctica, se puede explicar en 7 pasos:

1. Lisis celular - el Tris mantiene un pH constante de 7.8 aproximadamente. El EDTA es un agente quelante, el cual se emplea para proteger al DNA de la acción de nucleasas; captura los iones magnesio y no permite que actúen como cofactores de las nucleasas. La lisozima rompe los enlaces B-1,4 entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetil-D-glucosamina de la pared bacteriana. El SDS solubiliza lípidos de membrana y tiene un efecto inhibitorio sobre las DNAsas.
2. Remoción de RNA - la RNAsa se encarga de la degradación del RNA.
3. Remoción de proteínas - mediante disolventes orgánicos; el fenol desnaturaliza proteínas y éstas estarán rodeadas de micelas de fenol. El cloroformo desnaturaliza enlaces polipeptídicos para que vayan a la interfase entre el cloroformo y el agua; se necesita formar emulsiones entre estos dos por lo que se adiciona un emulsionante que es el alcohol isoamílico. (Surzycki, 2003)
4. Precipitación de DNA - por medio de etanol o isopropanol ya que el DNA es hidrofílico.
5. Concentración - con ayuda de la lectura de absorbancia a 260 nm para aplicar la ecuación  o bien la relación donde 1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 50 µg/mL de DNA.[pic 3]
6. Determinación de pureza - con ayuda de lecturas de absorbancias a 260 y 280 nm para aplicar la ecuación [pic 4]
7. Determinación del espectro de absorción - con ayuda de las lecturas de absorbancias a 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 y 280 nm. Un espectro de DNA se vería como lo muestra la Fig 1.

La temperatura de fusión (Tm) del DNA se refiere a la temperatura a la cual el 50% del DNA de una muestra se desnaturaliza de DNA de doble cadena a DNA de cadena sencilla. La menor proporción donde ocurre una desnaturalización es en las secciones ricas en GC, los pares de guanina-citosina (GC) aportan mayor estabilidad a la macromolécula que los pares de adenina-timina (AT).[pic 5]

                   Fig. 1 Espectro de absorción del DNA

Resultados

Tabla1. Determinación de la pureza y concentración de DNA cromosómico de Escherichia coli W3350, se expresan dos valores de concentración en μg/mL resultante de dos diferentes métodos para su cálculo.

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Fig. 2. Espectro de absorción del DNA cromosómico extraído de Escherichia coli W3350. (Equipo 8)

Tabla 2. Influencia de diferentes parámetros sobre la desnaturalización de oligonucleótidos empleando el programa DNAMAN.

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Discusión

Para la extracción del DNA cromosómico de E. coli W3350 se utilizó una combinación entre el método de Kirby y el de Marmur, para la realización se emplearon las mismas concentraciones de reactivos y concentración de células para cada equipo de la sección 2 del laboratorio de Genética microbiana, por lo que se esperaban valores de concentración y pureza similar en cada uno de los resultados obtenidos por los diferentes equipos; sin embargo, existieron variaciones tanto en concentración como en la pureza, siendo más notorias las diferencias entre concentraciones (Tabla 1).

Dichas variaciones pueden atribuirse al trabajo experimental realizado por cada equipo de la sección, pues la correcta realización de pasos críticos en el método de extracción repercute en la cantidad de DNA obtenido.

Como primer punto tenemos la resuspensión del paquete celular, si la suspensión no se realizó correctamente las células pudieron haber quedado adheridas a las paredes del tubo y quedarse en él, perdiendo así una gran cantidad de DNA.

Posterior a la resuspensión celular se emplearon agentes químicos para la ruptura de pared y membrana celular, si el paquete celular no se disgregó correctamente este proceso no tendría éxito.

En la extracción de DNA no hay dificultad para separar a las moléculas pequeñas, ya que el peso del DNA es muy grande; por lo que el RNA y proteínas son los principales contaminantes, (Surzycki, 2003), para la eliminación de estas macromoléculas se emplearon nucleasas (RNAsas) para la eliminación de RNA y un método “mixto” (Kirby-Marmur) empleando solventes orgánicos para la de extracción de proteínas.

La eliminación del RNA se llevó a cabo sin mayores complicaciones, por otro lado la extracción de proteínas representó un paso crítico en la determinación de la pureza y concentración del DNA aislado. El método implica la desnaturalización y solubilización de las proteínas en los solventes orgánicos atendiendo a su naturaleza hidrofóbica en el core de la proteína, por lo que realizar exitosamente una emulsificación entre fase orgánica y fase acuosa era imprescindible, pues de lo contrario, el DNA podría quedar inmerso en las proteínas o las antes mencionadas parcialmente solubilizadas en la fase acuosa representando un contaminante. Además la obtención de la fase acuosa sin tocar el lecho de las proteínas fue otro paso determinante.

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