Practica 13 "Aislamiento De DNA Plasmídico"

INTRODUCCIÓN

El termino DNA recombinante significa la unión o recombinación de dos piezas de DNA de dos diferentes especies. Esta técnica permite purificar un gen (clona) de una especie para insertarlo al DNA de otras especies, donde se replica junto con el DNA del hospedero.

El DNA esta constituido por dos cadenas de polidesoxirribonucleótidos formados por la unión de dAMP, dGMP, dCMP y dTMP.

La construcción de moléculas de ADN recombinantes y artificiales se denomina Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones genéticas por medios bioquímicos. El proceso también se denomina clonación molecular o clonación genética, porque se pueden propagar en una estirpe de organismos genéticamente idénticos, los cuales todos contienen la molécula compuesta y al crecer la amplifican, así como cualquier producto génico cuya síntesis sea dirigida por ella.

Plásmidos y clonación

Los plásmidos son moléculas de ADN circulares cerradas covalentemente (CCC) que poseen los procariotas y se heredan de manera estable en estado extra cromosómico. Esta definición implica homogenización genética, tamaño constante de las unidades monoméricas y la capacidad de replicarse independientemente del cromosoma. Los genes existentes en los plásmidos codifican para distintos caracteres fenotípicos como: resistencia a antibióticos, producción de antibióticos, resistencia a metales pesados, degradación de compuestos aromáticos, etc. Estos plásmidos pueden ser modificados para utilizarse como vectores de clonado (para amplificar un fragmento de ADN de interés), o como vectores de expresión (donde el fragmento de ADN insertado codifica para alguna proteína de interés).

Las características generales de un vector de clonación son: bajo peso molecular, contienen un origen de replicación, tienen capacidad de conferir caracteres fenotípicos fácilmente seleccionables en las células huésped (por ejemplo contienen un gen de resistencia a algún antibiótico) y poseen un sitio poli-linker o “MCS” (multiple cloning site), el cuál es una pequeña región con alto número de secuencias reconocibles por un diferentes de endonucleasas de restricción.

Extracción de ADN plasmídico

Existe una gran variedad de métodos para el aislamiento de ADN plasmídico, en particular para aquellos plásmidos encontrados en Escherichia coli y otras enterobacterias. Estos métodos se diferencian en la pureza del producto final, en el tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicarlos en aislamientos a pequeña o gran escala; sin embargo todos incluyen tres etapas comunes: crecimiento de las bacterias y amplificación del plásmido, cosecha y lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico.

La técnica de Miniprep o mini preparaciones de plásmidos, permiten la recuperación de plásmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las células con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuración superenrrollada del plásmido se mantiene estable.

La lisis alcalina es el método mayormente utilizado para el aislamiento de plásmidos circulares proveniente de células bacterianas.

OBJETIVO

Aislar DNA plasmídico bacteriano, comprobando dichos aislamientos mediante electroforesis en gel de agarosa.

PROCEDIMIENTO

 Obtención y aislamiento del DNA plasmídico (mini-prep).

1.- Se obtiene plásmido pUC 18 (El cual ya se nos fue entregado por los profesores debido al tiempo que tarda en obtenerse)

• Aislamiento

1. Se usan bacterias transformadas con un plásmido

2. Crecer las bacterias en medio Luria-ampicilina en fase logarítmica

3. Centrifugar 1.5 ml. del crecimiento bacteriano en un tubo eppendorf a 13000 rpm durante 5 min.

4. Desechar el sobrenadante y agregar 100 µL de la solución I (Glucosa-Tris-EDTA-RNasa A, donde el compuesto Tris actúa como regulador y el EDTA como agente quelante) resuspender con vortex e incubar 5 min. en hielo (esto es, para que no se expanda el cultivo).

5. Agregar

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