AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE DNA VEGETAL

AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE DNA VEGETAL

INTRODUCCIÓN:

El DNA genómico puede obtenerse a partir de cualquier microorganismo planta o animal en cualquier instante de su desarrollo, y nos provee de copias moleculares de genes de cada organismo. Este material puede entonces ser utilizado para la construcción de bibliotecas genómicas, en análisis de hibridación, como molde en reacciones de amplificación y secuenciamiento, entre otras aplicaciones. Las cantidades necesarias para realizar estos estudios son ínfimas ya que con unos pocos microgramos es suficientes.

Las técnicas de extracción de ácidos nucleicos son relativamente sencillas y tan solo es necesario evitar toda destrucción enzimática, mecánica de los mismos. Los ácidos nucleicos que son estables en la célula intacta, llegan a ser vulnerables a la digestión por las nucleasas endógenas, una vez que la célula es lisada. La diferencia entre cada método radica en el pre tratamiento, lo cual dependerá del origen del material, además deberá tenerse en cuenta de que el método de purificación tiene que ser perfectamente compatible con el uso futuro que se piensa dar al DNA purificado.

El DNA vegetal es más difícil de obtener de una forma que sea luego clonable o digerible, que el proporcionado por las células animales, debido principalmente a la presencia de metabolitos secundarios y polisacáridos los cuales interfieren con el procedimiento de extracción y purificación del DNA; algunos de estos problemas pueden superarse usando hojas sin expandir. Los tejidos de las plantas son robustos y por lo tanto requieren pree tratamientos intensivos, tales como largas incubaciones enzimáticas, molido en nitrógeno liquido con polvo de alúmina seguida por extracción con el tampón CTAB, etc.

El método aquí descrito proporciona cantidades relativamente puras de DNA genómico, lo cual puede utilizarse como molde de amplificación, con fines de Fingerprinting molecular.

OBJETIVOS:

• Aislar y purificar DNA genómico vegetal

• Entender la función que cada reactivo tiene en el protocolo de reacción

MATERIALES: Reactivos y Equipos

• Micropipetas

• Pipetas bacteriológicas

• Puntas de micropipeta

• Papel toalla

• Lejía

• Tubos de microcentrifuga (Eppendorf) de 1.5 ml

• Tubos de centrifugación (Falcon) de 50 ml

• Descartador de Tips

• Tris – HCl 1 M, pH 7,4

• EDTA 0.5 M

• NaCl 5 M

• SDS 10%

• Cloroformo

• Alcohol isopropil

• Etanol absoluto

• Buffer TE (Tris-HCl 50 mM, pH 8 y EDTA 1 mM)

• Buffer de maceración

• Baño María

• Centrifuga refrigerada

BUFFER DE MACERACION (CSP 50 mL)

 1 M TRIS – HCl, pH 7.4 10 ml

 0.5 M EDTA 2.5 ml

 10% SDS 2.5 ml

 5 M NaCl 2.5 ml

 Agua bidestilada hasta completar 50 ml

PROCEDIMIENTO

1. Colocar hojas de quinua (0,15 g) con 400 uL de buffer de maceración en un tubo de microcentrifuga nuevo. Homogenizar hasta que se muestre de color verde intenso

2. Sedimentar en la micro centrifuga a 14000 RPM x 1 min

3. Agregar un volumen de cloroformo y mezclar por inversión. Dejar reposar 5min a tº ambiente. Centrifugar x 5min en la micro centrifuga.

4. Transvasar el sobrenadante a un tubo nuevo

5. Transvasar 350 ul del sobrenadante y precipitar con 0.1 volúmenes de NaCl 5 M con uno de los siguientes alcoholes.

6. Alcohol isopropilico 1 volumen

7. Etanol absoluto 2 volúmenes

8. Dejar reposar a temperatura ambiente por 5 minutos, luego sedimentar en la microcentrifuga a velocidad

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