Pratica No. 1 DNA

• Introducción:

Aislamiento del DNA plasmidíco (Lisis alcalina)

Se requieren procedimientos especiales para obtener DNA plasmídico, un método popular aprovecha el hecho de que la lisis de la célula bacteriana determina cierto grado de rotura del cromosoma bacteriano lo que induce la pérdida del superenrrollamiento, por lo tanto un extracto celular contiene DNA cromosómico no superenrrollado y DNA plasmídico superenrrollado, una técnica consiste en añadir hidróxido de sodio hasta que el pH del extracto celular llegue a 12-12.5, que rompe los pares de bases del DNA cromosómico, las cadenas simples resultantes se enredan en la red insoluble de proteínas desnaturalizadas que puede extraerse por centrifugación lo que deja al plásmido superenrrollado en el sobrenadante. (1)

Para determinar la concentración de DNA de la muestra obtenida de nuestra extracción, se utiliza un método espectrofotométrico, donde los cambios de absorbancia de la luz U.V. nos indican la presencia de ciertos compuestos, en el caso del DNA se observa un máximo de absorbancia de 260nm y un mínimo de absorbancia de 234nm, la concentración se obtiene de la relación de absorbancia de DNA a 260nm entre el coeficiente de extinción del DNA de doble cadena (0.02µg-1cm-1); mientras que para conocer el grado de contaminación con proteínas se utiliza la relación de absorbancia a 260nm entre absorbancia a 280nm, esto se debe a que las proteínas con grupos aromáticos presentan una absorbancia máxima a 280nm, sin embargo el mayor indicador de contaminación de proteínas es la relación de absorbancia a 260nm entre la absorbancia a 234nm, ya que el DNA deja de absorber a 234nm y el enlace peptídico de las proteínas presenta una absorbancia máxima a 205nm.(2)

Los cambios de absorción de la luz U.V. también son útiles para seguir el proceso de desnaturalización del DNA así como la degradación de este, la fuerte absorbancia de las bases púricas y pirimidinicas presentan su máximo de absorción a 260nm pero la absorción del DNA en si es un 40% menor que una mezcla de nucleótidos, el DNA monocatenario absorbe en magnitud similar a los nucleótidos libres mientras que el DNA bicatenario absorbe menos, como consecuencia la desnaturalización del DNA se presenta como un aumento en la absorción a 260nm a este proceso se le conoce como efecto hipercrómico (el paso de DNA bicatenario a DNA monocatenario) y efecto hipercrómico residual (de DNA monocatenario a nucleótidos). El punto medio del intervalo de temperatura en el que se separan las cadenas de DNA se llama temperatura de desnaturalización (Tm), y esta depende de la proporción de pares de bases guanina-citosina (G-C) y adenina-timina (A-T), cuanto más pares de bases de G-C tiene un DNA mayor es la energía necesaria para separar las cadenas, puesto que entre estas pares de bases existen un total de tres puentes de hidrogeno que las unen, mientras que entre A-T solo existen dos puentes de hidrogeno. La desnaturalización del DNA es un fenómeno reversible, pues las cadenas complementarias tienen la capacidad de emparejarse entre las pares de bases y volver a formar una doble hélice (renaturalización). (3), (4), (5)

• Objetivos:

1. Aislar DNA plasmídico, a partir de un cultivo de Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido pCR2.1-TOPO y otro cultivo de Escherichia coli DH10B transformada con el plásmido Pcr2.1-TOPO-ape.

2. Establecer el espectro de absorción del DNA plasmídico aislado.

3. Determinar la concentración y grado de pureza del DNA plasmídico obtenido.

4. Mediante la aplicación del programa bioinformático DNAMAN, determinar la influencia de algunas características de la secuencia de DNA sobre su desnaturalización.

Equipo 7 Equipo 8 Equipo 9 Equipo 10 Equipo 11 Equipo 12

λ T A T A T A T A T A T A

230 21.73 14.51 20.51 26.38 24.44 14.26 8.51 20.49 29.83 30.07 11.76 31.34

240 30.60 20.57 29.83 37.83 35.08 20.95 11.22 30 39.28 43.96 17.72 45.67

250 45.52 30.22 44.04 56.27 52.22 31.23 15.75 44.61 54.49 64.59 25.76 67.02

260 51.27 33.61 49.32 63.43 58.57 34.63 17.23 49.76 61.36 73.14 28.72 76.1

270 39.58 25.95 37.96 48.43 45.24 26.57 13.68 38 48.11 56.70 22.31 58.41

280 23.64 15.35 22.56 28.91 27.02 15.67 8.21 22.57 29.17 34.34 13.59 35.41

290 9.37 6.04 8.97 11.56 10.62 6.16 3.41 9.02 11.88 13.43 5.69 13.85

300 1.65 1.13 1.64 2.13 1.88 1.09 0.7 1.71 2.33 2.31 1.38 2.37

50µl 40 µl 40 µl 60 µl 60 µl 60 µl

• Resultado:

Equipo Concentración del DNA plasmidíco obtenido Pureza del DNA plasmidíco obtenido

Concentración obtenida por la formula (µg/ml)* Concentración obtenida por la relación: 1 U de A260nm : 50 µg/ml de DNA de doble cadena~

T A T A A230nm º A280nm ¤

T A T A

7 2278.66 1493.77 2563.5 1680.5 2.35 2.31 2.16 2.18

8 2192 2819.11 2466 3171.5 2.40 2.40 2.18 2.19

9 2603.11 1539.11 2928.5 1731.5 2.39 2.42 2.16 2.20

10 765.77 2211.55 861.5 2488 2.02 2.42 2.09 2.20

11 2727.11 3250.66 3068 3657 2.05 2.43 2.10 2.12

12 1276.44 3382.22 1436 3805 2.44 2.42 2.11 2.14

*la fórmula utilizada fue:

C= As260nm donde Ae es el índice de absorción específica para el DNA (22,500)

Ae X b y b es el paso de luz de la celda en centímetros.

Para este experimento se utilizó el equipo nanodrop, el cual para el paso de la luz se le considera un valor de 1 por lo cual el cálculo fue el siguiente, tomando como ejemplo los datos del equipo 10 para la muestra T:

C= 17.23 ; C= 7.65X10-4 g/ml.

(22,500) (1)

Dado que la formula nos da un resultado en g/ml se realizó una conversión de g a µg de la siguiente manera:

1g----------- 1, 000,000µg 7.65X10-4 g ------------765.77µg

~Un ejemplo del cálculo obtenido con la relación absorbancia-DNA para la muestra T del quipo 10 es:

1unidad de As260nm de DNA de doble cadena ---------- 50µg/ml de DNA de doble cadena

As de 17.23 de DNA de doble cadena ------------------861.5µg/ml de DNA de doble cadena

º El ejemplo para obtener la pureza de DNA de la muestra T del equipo 10 con la primera relación:

Pureza = As 260nm ; pureza= 17.23 ; pureza= 2.02

As 230nm 8.51

¤Ejemplo para obtener la pureza de DNA de la muestra T del equipo 10 con la segunda relación:

Pureza= As 260nm ; pureza= 17.23 ; pureza = 2.09

As 280nm

...