Práctica De Azúcares Totales

Facultad de Ingeniería Química

Ingeniería en Biotecnología

“Práctica #4: Determinación de azúcares totales”

Bioquímica I

Integrantes:

Concha Syndel

Herrera Claudia

Ortega Juan Carlos

Vallejo Mario

30/04/15

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN 1

OBJETIVO 3

METODOLOGÍA 3

Preparación de reactivos 3

Procedimiento 3

RESULTADOS 5

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6

CONCLUSIÓN 8

ANEXO 1: Cuestionario 8

REFERENCIAS 11

INTRODUCCIÓN

Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes de la Tierra, conformados principalmente por cadenas de carbohidratos e hidrógenos por medio de una cadena simple. Entre las funciones destacan que son fuentes de energía, reserva, estructurales o comunicación celular

Los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. El contenido total de carbohidratos de medios líquidos, extractos o alimentos puede ser determinado como azúcares simples (monosacáridos), oligosacáridos (polímeros con dos hasta unos 20 residuos de monosacáridos), polisacáridos (son polímeros que contienen más de 20 residuos de monosacárido) y sus derivados (glucoproteína). Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. Este método propuesto por Dubois y cols. (1956) es un método fácil, eficaz y rápido. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar (Nielsen, 1998). La reacción de color para medir la concentración de carbohidratos por espectrofotometría se basa en la utilización del método colorimétrico de fenol-sulfúrico que depende de la deshidratación de sacáridos derivados de hidrolizados a furfural, que transcurre en el proceso de la reacción. Cuando estos compuestos reaccionan con fenol y en presencia de ácido sulfúrico concentrado se observa un color amarillo-naranja muy estable. Los derivados del furfural con las formas del fenol colorado adsorbe a longitud de onda de 490 nm.

Reacción:

FENOL + H2SO4 (concentrado) + CARBOHIDRATO  HMF (amarillo naranja)

Para hexosas (hidroximetilfurfural)

Para pentosas (metil furfusal)

OBJETIVO

Ensayar la cuantificación de carbohidratos totales por el método Fenol-ácido sulfúrico.

METODOLOGÍA

Preparación de reactivos

Fenol 5%. Pesar 5 g de fenol y agregar 95 mL de agua bidestilada.

Solución estándar de glucosa. Pesar 10 mg (0.01 g) de glucosa y disolverla en agua bidestilada aforando a 100 mL. Se tiene una solución de 100µg de glucosa/mL.

Solución de sacarosa 1%. Pesar 1 g de azúcar común y agregar 99 mL de agua destilada, disolver completamente.

Solución de almidón 1%. Pesar 1 g de almidón y agregar 99 mL de agua destilada. Agitar esta solución antes de usarse.

Procedimiento

Desproteinización de las muestras

1. Tomar 0.5 mL del cultivo con sacarosa y colocarlo en un microtubo.

2. Agregar 250 µL de Sulfato de zinc al 10%.

3. Adicionar 250 µL de NaOH 0.5N

4. Dejar reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente

5. Centrifugar a 10,000 rpm durante 5 min.

6. Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrifuga y reservar hasta la determinación de azúcares totales.

Determinación de azúcares totales

1. Tomar 1 ml de la solución de azúcar que contenga entre 10 y 70 µg. Algunas veces es necesario hacer diluciones de la muestra. Para esta práctica realizar las siguientes diluciones: Sacarosa (10:1000 veces), Almidón (10:1000 veces); Medio de cultivo con sacarosa (10:1000veces).

2. Añadir 0.5 ml de fenol 5 %.

3. Agregar 2.5 ml de ácido sulfúrico concentrado.

4. Mantener en reposo durante exactamente 10 min.

5. Agitar y poner los tubos en agua fría (25-30 °C) durante 15 min. También puede utilizarse un baño de agua con hielo y disminuir el tiempo. El color es estable por algunas horas y las lecturas pueden ser realizadas más tarde si es necesario.

6. Realizar las lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro a 490 nm. El color característico para hexosas es amarillo-naranja.

7. Preparar una curva estándar de glucosa como indica el cuadro siguiente.

Conc. De glucosa

µg/mL Sol. Estándard de glucosa (100 µg/mL) mL Agua (mL)

0 0 1.0

10 0.1 0.9

20 0.2 0.8

40 0.4 0.6

60 0.6 0.4

80 0.8 0.2

100 1.0 0.0

8. Aplicar a la curva estándar el mismo procedimiento descrito en los puntos 7 al 12 de este procedimiento.

RESULTADOS

Curva de calibración

Concentración de glucosa [µg/mL] Absorbancia 490 nm

0 0

10 0.119

20 0.121

40 0.280

60 0.371

80 0.481

100 0.560

Tabla 1. Datos curva de calibración

Absorbancias de las muestras

Muestra problema Absorbancia 490 nm

Sacarosa 0.716 0.67

Almidón 0.071 0.082

Medio cultivo (con proteína) 0.623 0.6

Medio cultivo (desproteonizado) 0.452 0.4

Tabla 2. Absorbancia de muestras

Hallando un promedio entre las absorbancias, se tiene:

Muestra Problema Absorbancia

490 nm Concentración de glucosa (µg/mL) Concentración de glucosa (g/L)

Sacarosa

0.693

104.646

0.104646

Almidón

0.0765

9.8

0.0098

Medio cultivo

(con proteína)

0.6115

92.107

0.092107

Medio cultivo

(desproteonizado)

0.426

63.569

0.063569

Tabla 3. Resultados finales

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

De acuerdo al método fenol-sulfúrico (Dubois et al., 1956), el fenol en presencia de ácido sulfúrico se puede utilizar para la microdeterminación colorimétrica cuantitativa de azúcares y sus derivados metílicos, oligosacáridos y polisacáridos. Este método es particularmente útil para la determinación de pequeñas cantidades de azúcares separadas con disolvente fenol-agua y también para aquellos azúcares que fueron

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