Que los alumnos conozcan sobre tinciones.

V. Tinciones

V.1 objetivo general

• Que los alumnos conozcan sobre tinciones

V.2 objetivos específicos

• Conocer las tinciones disponibles más comúnmente usadas
• Mencionar las ventajas y desventajas de las diferentes tinciones
• Conocer las diferencias en las tinciones

V.3 fundamento

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoración de las muestras, es  trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados.

Para aumentar la capacidad de resolución de un estudio microbiológico es necesaria la implementación de tinciones las cuales confieren de color y resaltan las estructuras de las bacterias favoreciendo a su mejor identificación.

A continuación se mencionan algunas funciones de las tinciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

2. Revelan su forma y tamaño.

3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

4. Producen reacciones químicas específicas.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular (inmunocitoquímico)

V.4 Tinciones

        V.4.1.Tincion de Gram

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.

En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se puede saber de manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una infección.

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa.

El cristal violeta tiene afinidad por el peptidoglicano lo cual primero se realiza la tinción de esta en los primeros pasos y se fija con el Lugol, posteriormente el alcohol acetona genera una ruptura en la membrana celular externa de las Gram negativas, dejando el libre acceso a la safranina la cual tiñe las bacterias que no fueron teñidas por el cristal violeta.

Elaboración:

• Se realiza un frotis de una colonia de los cultivos, con ayuda de una asa se frota a lo largo del portaobjetos y se trata de hacer una capa fina de colonia, se pasa brevemente por el mechero
• Se colocan unas gotas de cristal violeta y se deja reposar por 1 minuto
• Posteriormente se enjuaga con un poco de agua corriente del grifo
• Después se escurre suavemente el portaobjetos se agrega unas gotas de Lugol y se deja reposar por 1 minuto
• Se retira de nuevo el Lugol con un poco de agua corriente del grifo y se vuelve a escurrir suavemente
• Se añade unas gotas de alcohol-acetona y se deja actuar por 5 segundos y se enjuaga como en los pasos anteriores
• Por último se coloca unas gotas de safranina y se deja actuar otro minuto y de nuevo se vuelve a enjuagar
• Se deja secar y se observa al microscopio.

[pic 1]

Interpretación:

• Bacterias Gram positivas: color violeta-morado
• Bacterias Gram negativas: color rosado

[pic 2]  [pic 3]

        V.4.2 Tincion de Wright

La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre y es clasificada como una tinción policromática, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula.

Esta tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B a una concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico.

La eosina es un colorante ácido que tiene afinidad por componentes alcalinos. La tonalidad resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos. El típico color de los núcleos celulares, mayoritariamente morado, se basa en la interacción molecular entre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. La intensidad de la coloración depende del contenido de azur B y de la relación con la eosina amarilla. El resultado de la tinción puede ser influido por diferentes factores, como el valor del pH de los colorantes y de la solución amortiguadora, esto debido a que la tinción se fundamenta en la relación de las características ácido-base.

Reactivos:

Colorante de Wright

Eosina-azul de metileno 0.8g/l

Alcohol metílico                1L

Buffer Giordano pH 7 para Wright

Fosfato acido de sodio 12 H2O  14.02 g/l

Fosfato diacido de potasio       3.522 g/l

Agua desmineralizada tipo II

Elaboración:

• Realizar un frotis en una placa un extendido de la muestra con el borde de otra placa. Dejar secar
• Colocar el frotis de sangre completamente secos, en la gradilla de tinción adecuada
• Cubrir el portaobjetos con 1-2 ml de colorante de Wright
• Tras 1 minuto, añadir un volumen igual de buffer Giordano pH7 para Wright,  esparcir hasta que la muestra tenga una coloración verde metalico
• Dejar actuar de 3 a 6 minutos.
• Lavar con agua corriente, dejar secar a temperatura ambiente.
• Leer al microscopio con un objetivo de 40X o 100X con aceite de inmersión.

[pic 4]  [pic 5]

Interpretación:

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