TINCIÓN DE ESPORAS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO[pic 1][pic 2][pic 3]

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

BIOLOGIA Y ECOLOGIA MICROBIANA

PRACTICA # 4        [pic 4]

TINCIÓN DE  ESPORAS

PROFESOR

DR. GABRIEL LEYVA RUELAS

Grado: 5º     Grupo 03      EQUIPO No

Integrantes:[pic 5]

• CRUZ FRANCISCO RAFAEL
• FELIX ARREDONDO JUAN MANUEL
• MIRANDA LENDESMA ANA KAREN
• PADILLA PÉREZ BRAULIA
• POLO FLORES ISMAEL

                                        CHAPINGO, EDO. DE MÉXICO A 1 DE SEPTIEMBRE DE   2015

INTRODUCCION:

[pic 6]Algunas especies de dominio Bacteria producen intracelularmente unas estructuras especiales llamadas endoesporas, durante un proceso denominado esporulación. Las endoesporas son células diferenciadas, extraordinariamente resistentes al calor, a agentes químicos agresivos y a la radiación, que funcionan como estructuras de supervivencia, capacitando así al organismo para resistir condiciones adversas como temperaturas extremadas, desecación, limitación de nutrientes y muchas más. Las endoesporas representan el estado durmiente de un ciclo de vida bacteriana del tipo: célula vegetativa              endospora   [pic 7] célula vegetativa. Las endosporas son también una estructura ideal de dispersión por el viento, el agua y el intestino de animales. Las bacterias que forman endosporas se encuentran habitualmente en el suelo y los géneros endosporulantes mejor estudiados son Bacillus y Clostridium.

Formación de endosporas y germinación

Durante la formación de endosporas, una célula vegetativa se convierte en una estructura inerte y termoresistente. Las células no esporulan cuando están en crecimiento sino cuando cesa el crecimiento debido a la desaparición de un nutriente esencial. Por ejemplo, las células de Bacillus, una bacteria típica formadora de endosporas, cesan el crecimiento vegetativo y comienzan la esporulación cuando un nutriente carbonado o nitrogenado llega  a  ser una factor limitante.

Una bacteria es capaz de permanecer en estado latente durante muchos años, pero también puede dar lugar a una célula vegetativa de un modo relativamente rápido. Este proceso ocurre en tres pasos: activación, germinación y crecimiento. La activación se logra fácilmente por calentamiento de las endosporas recién formadas, a una temperatura subletal pero elevada. Las endosporas activadas quedan así condicionadas a germinar cuando se colocan en presencia de nutrientes adecuados, algunos aminoácidos (la alanina es particularmente activa en poner en marcha la germinación). La germinación es normalmente un proceso rápido que ocurre en cuestión de minutos y supone la pérdida de refringencia de la espora, un aumento en la capacidad de tinción por colorantes, y la perdida de resistencia al calor y a compuestos químicos. El estado final o fase de crecimiento se caracteriza por un hinchamiento visible de la célula debido a la acumulación de agua y a la síntesis de RNA, proteínas y DNA. A continuación la célula emerge una vez rota la cubierta de la endospora y comienza a crecer manteniendo el estado vegetativo hasta que nuevamente detecta señales ambientales que ponen en marcha la esporulación.  

Las endosporas aparecen por microcopia óptica como estructuras muy refráctiles. Estas formaciones son impermeables a la mayoría de los colorantes, de modo que con frecuencia se observan como regiones no teñidas dentro de las células que han sido teñidas con colorantes básicos como el azul de metileno. Para teñir las endosporas se deben usar procedimientos especiales utilizando un protocolo clásico con la colorante verde malaquita suministrada en caliente(Michael et al, 2009)

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OBJETIVOS:

• Observas las esporas bacterianas de la especie Bacillus subtilis.

MATERIALES Y REACTIVOS:

• Cofia y cubrebocas
• Asa bacteriologica
• Mechero de Bunsen
• Gradilla
• Encendedor
• Microscopio compuesto
• Cloro
• Alcohol
• Verde de malaquita
• Safranina para esporas
• Aceite de inmersión
• Cultivo microbiano

• Bacillus subtilis

METODOLOGIA

1. Primeramente se procedio a preparar el frotis

Colocar en el portaobjetos una gota de agua, luego esterilizar el asa bacterialogica para posteriormente tomar una pequeña muestra del cultivo microbiano y colocarlo sobre la gota de agua del portaobjetos, dispersarlo aproximadamente 1 cm2  con la intension de que las bacterias no queden encimadas. Secar la muestra con el calor de los mecheros( a todo el proceso anterior se le conoce como frotis).

1. Aplicar verde de malaquita al frotis de 2 a 3 minutos en frio.
2. Pasados los 2 – 3 minutos se le aplica calor a la preparación a fuego lento por 5 minutos, procurando que no se quiebre el portaobjetos.
3.  Se procede a lavar y secar al aire la muestra.
4. Se le aplica Safranina para esporas de 2 a 3 minutos.
5. Se procede a lavar y secar al aire la muestra.
6. Se procede a observar al microscopio.

Resultados: 

Como se muestra en la siguiente imagen (ilustracion 2) la micrografia  de la endospora, de la celula Bacillus subtilis, el color  verde se debe al colorante verde de malaquita, que tiñe especificamente a la cuticula de la encdospora.

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