Taller De Microbiologia

FUNDAMENTOS DE ANTIBIOGRMAS Y PRUEBAS ESPECIALES (1,2,3,4)

1. ENUMERE LOS METODOS

1. Métodos de dilución

A. Caldo: se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo. El caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio. Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) (ver esquema ampliado).

Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de agar (la pequeña cantidad del agente antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se elimina por dilución en el agar), y el número de colonias que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del cultivo original. Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana, la mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM) o concentración letal mínima (CLM).

B. Agar: en medio sólido, Es considerado el método de referencia. En este método, placas conteniendo una determinada concentración de un antibiótico son inoculadas con el microorganismo en estudio y luego incubadas por 16 a 18 horas. Después de la incubación, se examina si el organismo crece o no en cada una de las placas, con lo cual se determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) para el antibiótico. Si una cepa de S.aureus crece en una placa que contiene una concentración de oxalina de 0,06 ug/ml pero no crece en una placa con una concentración de oxalina 0, l2 ug/ml, significa que la CIM de oxalina que se requiere para inhibir a ese organismo es 0,12 ug/ml.

El medio con antimicrobiano se vierte cuanto antes (para evitar que el agar se solidifique) en placas de Petri estériles, evitando la formación de burbujas que dificultarían la posterior inoculación de las placas. Para placas circulares de 90 mm de diámetro son necesarios 20 ml de medio con antimicrobiano (habitualmente en la proporción 19 ml de medio por 1 ml de solución de la correspondiente concentración de antimicrobiano). Posteriormente se dejan solidificar las placas, que se usarán inmediatamente o se almacenarán en frigorífico en bolsas de plástico. Para trabajos de referencia las placas no se deben almacenar más de cinco días, sin olvidar que algunos antimicrobianos (como ampicilina, meticilina, imipenem, ácido clavulánico,...) son poco estables a 4-8ºC y, por ello, las placas que los contienen se deben usar el mismo día de su preparación

Tras sacar las placas del frigorífico, se deben dejar a temperatura ambiente unos 30 minutos antes de proceder a su inoculación, comprobando que no exista agua de condensación en la superficie de las mismas. Las placas húmedas se pueden secar en estufa dejando las tapas entreabiertas. En cualquier caso, la evaluación de los resultados obtenidos con placas almacenadas según las condiciones indicadas sólo debe realizarse cuando los resultados con las cepas de control estén dentro de los márgenes indicados (ver más adelante). Para cada serie de concentraciones se debe incluir al comienzo y al final de las mismas sendas, placas de medio sin antimicrobiano que servirán para controlar el crecimiento y la posibilidad de contaminación durante el proceso de inoculación

2. Métodos de difusión:

A. Kirby Bauer : método más utilizado es la prueba de difusión en disco. Se coloca un disco de papel filtro que contiene determinada cantidad de un fármaco en la superficie de un medio sólido en el que se ha sembrado el microorganismo investigado. Después de la incubación, se mide el diámetro de la zona transparente de inhibición que rodea al disco como medida del poder de inhibición que tiene el fármaco contra el microorganismo investigado. Este método está sujeto a una serie de factores físicos y químicos además de la interacción simple entre el fármaco y el microorganismo (p. ej., la naturaleza del medio y el potencial de difusión, el tamaño molecular y la estabilidad del fármaco). Sin embargo, la estandarización de estas circunstancias permite establecer la sensibilidad del microorganismo.

La interpretación de los resultados de las pruebas de difusión se debe basar en comparaciones entre métodos de dilución y difusión. Estas comparaciones han ocasionado la creación de referencias estándar. Las curvas de regresión lineal expresan la relación entre el logaritmo de la concentración mínima inhibidora en las pruebas de dilución y el diámetro de las zonas de inhibición en las pruebas de difusión.

Si se utiliza un solo disco para cada antibiótico con estandarización cuidadosa de las condiciones de la prueba, es posible establecer si un microorganismo es sensible o resistente al comparar el tamaño de la zona de inhibición con un estándar del mismo fármaco. La inhibición alrededor de un disco que contiene cierta cantidad de un antimicrobiano, no significa que el microorganismo sea sensible a esa misma concentración por mililitro de medio de cultivo, sangre u orina.

B. E-test: Es uno de los métodos más recientes que se han presentado en el mercado y resulta de una curiosa combinación de características de los métodos anteriores. Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira. Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que resulta un método ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientos especiales para crecer. El microorganismo a investigar se inocula en una placa

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