Vitaminas

TECNICAS DE DETERMINACIÓN DE VITAMINAS

VITAMINAS LIPOSOLUBLES

• Las vitaminas A, D, E, K y los carotenoides activos de provitamina A están siendo determinados principalmente utilizando HPLC.

• Los métodos para vitamina A y E son relativamente fáciles de seguir por analistas experimentados, si se observan cuidadosamente las etapas más críticas.

• La determinación de la vitamina D y vitamina K es más difícil básicamente debido al bajo contenido encontrado en los alimentos.

VITAMINA A

La vitamina A se utiliza como un nombre genérico para describir al retinol, sus ésteres y los correspondientes isómeros.

Primeramente, se determinaba la vitamina A mediante una reacción colorimétrica de retinol con tricloruro de antimonio (reacción de Carr-Price). El retinol obtenido después de saponificar y extraer los componentes no saponificables tenía que ser purificado utilizando cromatografía de columna abierta con el fin de eliminar los componentes interferentes.

Extracción, evaporación y dilución

La vitamina A es extraída de la solución de saponificación por medio de un solvente adecuado por ejemplo: éter dietílico, tertbutil metil éter, n-hexano3 a 4 veces, con volúmenes que fluctúan de 50-150 ml. Los extractos combinados son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).

Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporación utilizando un evaporador rotatorio bajo un vacío parcial y a una temperatura que no exceda 50°C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o destilación azeotrópica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separación de fases.

El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase móvil u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentración apropiada para la inyección dentro de la columna de HPLC. Esta la solución final de la muestra.

Saponificación

La mayoría de los procedimientos de análisis están utilizando una etapa de saponificación antes de la extracción con un solvente orgánico adecuado. Una comparación de los métodos basada en los datos obtenidos en un estudio revela que las condiciones para la saponificación pueden variar dentro de ciertos límites sin afectar los resultados.

Generalmente 2-10 g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrógeno utilizando una mezcla de hidróxido de potasio acuoso, etanol o metanol, agua y con la adición de un antioxidante como acido ascórbico, pirogalol o BHT. Los antioxidantes deberían ser agregados a la muestra antes de la adición de la solución de hidróxido de potasio.

El tiempo normal de saponificación es entre 15-45 minutos con temperaturas que fluctúan de 80 a 100°C (reflujo).

HPLC

Condiciones de los sistemas de cromatografía para vitamina A

CONCLUSIONES

1. La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidación.

2. La saponificación bajo reflujo debería llevarse a cabo preferentemente bajo nitrógeno utilizando antioxidantes.

3. Los antioxidantes (BHT) deben agregarse antes de la evaporación de los solventes bajo un vacío parcial y sin exceder 50°C.

4. Separar adecuadamente el retinol y sus isómeros de los otros componentes.

5. Control espectrométrico de la pureza del estándar.

6. Informar las unidades relacionadas al resultado.

7. Hacer una referencia a los análisis de carotenoides, dado que algunos tienen actividad de vitamina A tal como el β-caroteno.

VITAMINA D

La vitamina D de efecto antirraquítico se encuentra en diversas formas; las dos más importantes son la vitamina D2, ergocalciferol, previamente conocida como calciferol y la vitamina D3, colecalciferol.

Saponificación y extracción

La vitamina D2 y la vitamina D3 son extraídas de los alimentos mediante saponificación utilizando una solución alcohólica de hidróxido de potasio seguida de una extracción del solvente. La determinación de vitamina D2 y D3 en una solución apropiada del extracto de la muestra se realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analítica.

De 10 a 30g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrógeno utilizando una mezcla de etanol o metanol, agua, un antioxidante tal como ácido ascórbico, hidroquinona, pirogalol o BHT e, hidróxido de potasio acuoso. El antioxidante debería agregarse a la muestra antes de la adición de la solución de hidróxido de potasio necesaria para la saponificación.

El tiempo normal de saponificación es de 20-45 minutos con temperaturas que fluctúan de 80 a 100°C.

Proporción de reactivos para saponificación

• La vitamina D2 y D3 son extraídas de la mezcla enfriada de saponificación por medio de un solvente adecuado.

HPLC

Sistema semipreparativo (fase normal)

Un estándar mixto de vitamina D2 y D3 es cromatografiado en el sistema HPLC semipreparativo y la condiciones optimizadas de tal manera de obtener con un tiempo de retención

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