Biotecnologia

DETERMINACIÓN DE BIOMASA: RECUENTO MICROSCÓPICO EN CÁMARA DE NEUBAUER

INTRODUCCIÓN:

El recuento de Biomasa es una prueba utilizada en laboratorios para determinar la concentración celular que se encuentra en una solución dada.

El recuento de Biomasa se mide en unidades de concentración (cel/ml) y; este se realiza mediante diferentes métodos de recuento, tales como: Recuento Microscópico, Recuento en Placas, Método Peso Seco (para métodos directos de recuento), Turbidimetría (para método indirecto).

Las cámaras de recuento, como la de neubauer, son instrumentos de precisión para la determinación del número de partículas e líquidos, los cuales son fabricados de un vidrio óptico especial que permite una mejor visualización de la muestra.

Esta cámara de neubauer, viene a ser una modificación de la cámara de BURKER que antiguamente existía y que era utilizado para la observación de glóbulos rojos en la sangre.

FUNDAMENTO TEÓRICO:

Constitución de Cámaras de Recuento:

Las cámaras de recuento para la investigación de suspensiones de células tienen 2 retículos. Estos retículos son grabados en dos áreas planamente esmeriladas y pulidas en el fondo de la cámara, el cual se encuentra entre 2 elevados soportes que también son planamente esmerilados y pulidos. Un cubreobjetos de 0.4 mm de espesor, que está posicionado encima de ambos soportes, limita los volúmenes a investigar encima de los retículos. Dependiendo del tipo de cámara entre los retículos y cubreobjetos resultan capilares de diferentes alturas.

Tenemos 2 líneas:

Líneas oscuras.-En las cámaras de recuento estándar el retículo es grabado en el fondo de la cámara y bajo el microscopio aparece como una red de líneas oscuras.

Líneas claras.-En las cámaras de recuento con líneas claras, el retículo es grabado en una capa de radio templado y bajo un enfoque normal del microscopio aparece en color claro. Mediante un cambio del contraste también puede ser realizado en color oscuro.

Metodología para contar bacterias en Cámara de Neubauer:

Esta cámara nos permite contar glóbulos y está diseñada de manera tal de contener una cantidad fija de líquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadrito. Cada uno de ellos esta, a su vez dividido en 16 cuadrados.

Se coloca un cubre-objetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre 2 hombros laterales de manera que cuando hay un contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubre-objetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3

OBJETIVOS:

General:

Determinar la concentración de células por conteo en cámara de Neubauer.

Específicos:

Reconocer la técnica de contaje en cámara de Neubauer.

Comparar estadísticamente los valores de concentración obtenidos.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Materiales:

Cámara de Neubauer

Jeringa

Microscopio

Material biológico: Suspensión de levaduras en crecimiento exponencial

Metodología:

Preparar una dilución de 0.5 gr. De levadura con 10 ml. de agua.

Hacer diluciones 10-1, 10-2

Extender esta dilución en la cámara de Neubauer con la ayuda de una jeringa.

Observar y contar la cantidad de celular en las diferentes zonas de la cámara.

Con la cantidad total contada, hallar la Concentración.

RESULTADOS:

Para obtener los resultados se hizo conteo con ayuda del microscopio.

Se realizó el conteo conforme se puede ver en la figura 1.

Figura1. Esquema de orden para realizar el conteo

Con lo cual pudimos obtener los siguientes datos:

Tabla 1. Datos obtenidos en Laboratorio.

8 6 10 10 5

9 5 2 10 6

4 2 6 3 1

10 4 5 7 5

12 7 5 2 6

Tabla 2. Conteo de células de levadura con disolucion en agua

Microcelda CANTIDAD

1 8

2 6

3 10

4 10

5 5

6 6

7 10

8 2

9 5

10 9

11 4

12 2

13 6

14 3

15 1

16 5

17 7

18 5

19 4

20 10

21 12

22 7

23 5

24 2

25 6

Promedio: N ̅ = 6 cel.

PARA LAS 25 MICROCELDAS

Hallamos concentración:

[ ] = N ̅/Vol x 1/D= (6 cel)/((0.2x0.2x0.1)mm^3 ) ((10^3 mm^3)/1mL)x 1/(10^(-2) ) = 1.5 x 108 cel/ml

Hallamos la desviación estándar y el coeficiente

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