Obtención de Cultivos Puros de Bacterias y Hongos

Practica No. 7

Obtención de Cultivos Puros de Bacterias y Hongos

Objetivos:

1. Aislar o separar uno o as microorganismos presentes en un sustrato, para la obtención de cultivos puros, mediante su desarrollo en medios sólidos.
2. Practicar la siembra por estría en medios sólidos.
3. Practicar los procedimientos empleados en la preparación de medios de cultivos.
4. Practicar el uso correcto de la autoclave.

Introducción:

Se entiende por aislamiento, el proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en un sustrato, forzándonos a crecer en medios de cultivos artificiales. No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios artificiales, es el caso de los organismos biotróficos (parásitos obligados), solo se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (viroides, virus, rickettsias y algunos hongos.)

Cultivo Puro: Es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que o componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denominan cepas.
En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y luego su posterior identificación (familia, genero, especie).

Aislamiento de Bacterias:
Entre los métodos as utilizados en la bacteriología, para la obtención de cultivos puros, tenemos:

1. Siembra por estrías en placas de Petri.
2. Técnica del vaciado en placas de Petri (medio solido) y dilución seriada en medios líquidos.
3. Técnica del micromanipulador.

a) Siembra por estrías en Placas de Petri:
Con un asa de platino o nicromo, previamente esterilizada en llama de un mechero, se deposita en un medio solido una pequeña cantidad de muestra y se distribuye extendiéndola sobre el medio. A partir de esta descarga y con un asa estéril diferente, se realizan nuevas estrías para diluir la carga microbiana, de este modo las bacterias se van distribuyendo sobre la superficie del agar y separándose unas de otras. Las bacterias se adhieren a la superficie del medio y se multiplican formando colonias. Cada una de estas colonias se origina a partir de la multiplicación de una sola célula. Al trasladar una de estas colonias aislada a una nueva placa (resiembra), se obtendrá un cultivo puro en el que todas las colonias presentaran las mismas características.
Este procedimiento de siembra por estrías en placas de Petri con medios solidos es el procedimiento habitual para aislar en cultivo puro.

b) Técnica del vaciado en placas de Petri (medio solido) y dilución seriada en medios líquidos.
El método del vaciado en placa consiste en que por medio de un asa de platino o de nicromo, se transfiere una pequeña cantidad de inoculo a partir de una suspensión bacteriana, esporas de un hongo, o de un cultivo mixto, a un tubo con agar nutritivo fundido y enfriado a 45°c (tubo A). El tubo se hace girar para mezclar bien el material inoculado. Con una pipeta Pasteur estéril se traslada una pequeña cantidad de la suspensión desde el tubo A a otro tubo que también contenga agar nutritivo en las mismas condiciones, (tubo B) y desde este se realiza el mismo procedimiento a un tubo C, mezclando bien después de cada traspaso.
El contenido de los tubos A, B y C, se vierte por separado en cajas Petri estériles. Las placas de Petri se incuban a la temperatura deseada por un lapso de 24 a 48 horas, luego se examinan para buscar colonias aisladas. Para la obtención de un cultivo puro, se resiembra una colonia aislada a otra placa de Petri con medio nutritivo y se incuba por 24 a 48 horas a la temperatura deseada.

c) Técnica del Micromanipulador:
El micromanipulador se utiliza asociado al microscopio y permite tomar un solo microorganismo desde una preparación en gota pendiente. A través del micromanipulador, el operador puede dirigir el movimiento de una micropipeta dentro de una gota pendiente y tomar una sola célula bacteriana que se transfiere a un medio apropiado para su desarrollo. Esta técnica se utiliza en estudios especializados como en genética y se requiere de mucha practica y habilidad para lograr trabajar con ella.

Aislamiento de Hongos a partir de Micelio o Esporulación:
Con un asa previamente flameada en la llama del mechero y enfriada, se procede a extraer una pequeña cantidad de micelio o esporas del hongo y se depositan en la placa de Petri con medio de cultivo adecuado. Si el hongo a aislar careciera de esporulación o micelio, el sustrato se deja en una cámara húmeda durante 24-48 horas a 20°C.
Con el objeto de inhibir el desarrollo bacteriano en el aislamiento de hongos, se utilizan compuestos como antibióticos o ácido láctico al 25% (3-5 gotas por 100 ml de medio de cultivo estéril) que se adicionan al medio de cultivo.

Materiales:

-Placas con Agar (2 cajas por equipo + la control): Agar Eosina Azul de Metileno, Agar Manitol Salado, Brolacin (CLED), Agar Soya Tripticasa, Agar Saboraud.
-Hisopos estériles.
-Asas de alambre de nicromo.
-Mechero Fisher con manguera.
-Portaobjetos.
-Varilla de vidrio para tinción.
-Vaso de precipitados.
-Papel especial para limpieza de lentes de microscopio.
-Termómetro de -10 a 110°C.
-Vaso de Precipitados de 250 ml
-Plumón indeleble.
-Cinta maskin.

Soluciones:
-Solución higienizante (iodoforo).
-Colorantes de Gram: Cristal Violeta, Safranina.
-Alcohol-Acetona de Gram.
-Lugol para tinción de Gram

Equipo:
-Estufa de incubación, a una temperatura de 35-37°C.
-Microscopio

Procedimiento:
Recolección de la Muestra o Inoculo:

1. Utilizar un hisopo estéril para obtener la muestra del sustrato o material que se desea cultivar. Frotar el hisopo y girarlo sobre la superficie del tejido o material sólido, o sumergirlo en el sustrato si es un material líquido.

Siembra de la muestra o inoculo:

1. Colocar las placas con los medios de cultivo que se utilizaran para la siembra en forma invertida cerca de un mechero.
2. Levantar la parte de la placa que contiene el agar junto a la llama y descargar el inoculo en un extremo de la placa frotando el hisopo y girándolo sobre la superficie del medio en forma suave.
3. Regresar la placa a la posición invertida sobre la mesa. Colocar el hisopo en una bolsa para desinfección o eliminación posterior.

Aislamiento por estriado:

1. Flamear en la llama del mechero dos asas de nicromo hasta que alcance un rojo incandescente. Dejarlas enfriar por lo menos 10 segundos junto al mechero.
2. Levantar la placa inoculada junto a la llama y arrastrar parte del inoculo depositado con el hisopo utilizando un de las asas previamente flameadas. Realizar una o dos estrías en forma perpendicular a la descarga y hacia el área virgen del medio, estriar sobre ellas con estrías muy juntas en un tercio del área del medio. Flamear el asa y enfriar junto al mechero.
3. Realizar una nueva serie de estrías a partir de las realizadas previamente, siguiendo el mismo procedimiento con un asa estéril y fría, hasta utilizar toda la superficie del medio.
   Ver la Figura 1.

Promoción del desarrollo microbiano:

1. Colocar las placas dentro de la estufa de incubación en forma invertida, a una temperatura de 35-37°C por 24-48 horas.
2. Retirar las placas de la estufa de incubación y observar junto a la llama del mechero la distribución y abundancia de crecimiento microbiano.

Morfología y respuesta al Gram de las cepas seleccionadas:

1. Seleccionar y registrar las características de las diferentes colonias desarrolladas y que se encuentren aisladas o separadas del crecimiento masivo.
2. Preparar frotis microbianos de las colonias seleccionadas y teñir mediante la técnica de Gram.
3. Observar y registrar los tipos morfológicos, así como su coloración al Gram.
   [pic 1]

Dibujos:

Dibujar medios y colonias desarrolladas.[pic 2][pic 3][pic 4][pic 5]

Dibujar las formas microbianas observadas.[pic 6][pic 7][pic 8][pic 9]

Conclusiones:

De acuerdo con las características de las colonias, la morfología microscópica y la tinción de Gram las cepas aisladas corresponden posiblemente a los siguientes géneros:

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