Análisis de los efectos de fitohormonas en plantas de Zea mays por medio técnicas de biología molecular

Análisis de los efectos de fitohormonas en plantas de Zea mays por medio técnicas de biología molecular

Erick Susano Lopez 1 y Carlos Alberto Contreras Paredes1,2

1 Licenciatura en Biotecnología, 2 Jardín Botánico Universitario

Resumen

Los brasinoesteroides son fitohormonas capases de generar efectos sobre las plantas de maíz en su fenotipo, que permiten desarrollar resistencia a algunos tipos de estrés abióticos, los efectos de los mismos se pueden ver reflejados a nivel de trascripción en algunos genes que se expresan de manera diferencia si son comparadas unoa condición estándar respecto a otra sometida a tratamiento. El uso de herramientas de biología molecular nos permite entender mejor los efectos de los mismos y saber si los genes SOD y HSP90 (codificantes para una superóxido dismutasa y para una proteína de choque térmico respectivamente) sufren algún cambio en su expresión a causa de los tratamientos y las condiciones a las que son sometidas las plantas.

Introducción

 Los brasinoesteroides, fueron descubiertos en 1968 por Marumo a partir de extractos metabólicos de la planta Distylium racemosum. En la actualidad son considerados como la sexta fitohormona, químicamente son la única familia de hormonas con estructura polihidroxiesteroidea, su estructura está compuesta de entre 27 a 29 átomos de carbono dependiendo de la estructura y numero de cadenas latera presente en él. [1]

Se encuentran ampliamente distribuidos en un gran número de especies vegetales que los producen en muy bajas concentraciones, se sabe que actúan como reguladores del crecimiento y elongación celular, pero además confieren a algunas plantas características de resistencia a algunos tipos de estrés bióticos y abióticos, como lo son la temperatura, limitaciones hídricas, concentraciones de minerales en el suelo, e incluso resistencia al ataque de ciertos patógenos [2]. Existen evidencias que demuestran el efecto positivo en el incremento de diferentes cultivos como el maíz y el jitomate, los cuales representan una fuente alimenticia primordial para muchos países [3].

Se sabe que los brasinoesteroides tienen efectos sobre la expresión de algunos genes de maíz a nivel trascripcional, induciendo cambios a nivel de fenotipo, y en el desarrollo de capacidades de resistencia para algunos tipos de estrés abiótico. Al igual que éste tipo de hormonas, algunos compuestos análogos han mostrado tener efectos sobre las plantas; en el laboratorio de modificación de productos naturales de la facultad de Ciencias Químicas de la BUAP, se generaron compuestos novedosos que promueven el crecimiento vegetal con efectos parecidos al desarrollado por análogos de brasinoesteroides, dichos cambios pueden ser evaluados mediante el uso de herramientas de biología molecular, tales como PCR punto final y electroforesis en gel de agarosa.

Dentro de las plantas de maíz existen una variedad de genes relacionados con el estímulo por hormonas vegetales, en éste estudio se revisará la expresión de algunos de plantas de maíz tratadas con los compuestos llamados aBSS4, aBSS18 y un homobrasinolida. Se evaluará la expresión del gen superóxido dismutasa (SOD) como un gen relacionado con el sistema de defensa contra las especies reactivas de oxigeno producidas como consecuencia del metabolismo de las plantas, y que se ven aumentadas en condiciones de estrés térmico e hídrico [4]. Por otro lado el gen responsable de codificar la proteína de choque térmico 90 (HSP90) la cual está relacionada de igual manera con el estrés hídrico y térmico, esta contribuye a funcionar como un chaperona y un protector de otros proteínas y complejos proteicos, para evitar la pérdida de su estructura funcional y poder continuar con las funciones vitales del organismo aun en condiciones desfavorables.

Desarrollo del trabajo de investigación.

Se tomó tejido de la raíz primaria y el hipocotíleo de plantas de maíz crecidas por cinco días a una temperatura de 24°C con un porcentaje de humedad de 30% y con un fotoperiodo de 12 horas de luz, tratadas con los compuestos denominados aBSS4 y aBSS18 sintetizados en la BUAP por el grupo de investigación del Dr. Jesús Sandoval Ramírez, además del análogo de brasinoesteroide comercial homobrasinolida y un control de agua. Se procedió a extraer el RNA total de este tejido utilizando el kit comercial TRizol Reagent (Invitrogen, Thermo Scientific, California USA) con el protocolo provisto por el fabricante.

Una vez obtenido el RNA total se procedió a evaluar su integridad por medio de una electroforesis utilizando un gel de agarosa al 1% disuelto con TBE 0.5X y adicionado con 1ul de bromuro de etidio como agente intercalante que se corrió a 70v durante 30 minutos obteniendo

los siguientes resultados.[pic 1]

En la ilustración 1 se pueden ver tres bandas correspondientes a los RNA ribosomales 28S, 18S y pequeños RNAs, de arriba hacia bajo respectivamente. Lo cual indica integridad y que no existe algún barrido que indique degradación en el mismo. Posteriormente se utilizó una técnica espectrofotométrica para saber la concentración y calidad del RNA utilizando la relación de absorbancia a 260/280 nm los resultados son los siguientes:

[pic 2]

La relación 260/280 debe de ser mayor de 1.7 y menor a 2, esto significa una calidad óptima para el proceso de retrotrascripción para generar cDNA de los mRNA, para este proceso se utilizó el kit “M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, Thermo Scientific, California USA) utilizando las especificaciones del fabricante.

Una vez obtenido el cDNA se usaron oligonucleotidos específicos para realizar PCR con los cDNA sintetizados.

...