BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUCCIÓN

La identificación con ADN o “huella genética” se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que poseen la característica de ser altamente variables o polimórficos entre los mismos. El análisis de un determinado número de estas secuencias o fragmentos de ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad muy cercana al 100%. Además de ser muy polimórfico, el ADN que se utiliza para la identificación en Genética Forense es un ADN no codificante o no expresivo, por lo que no revela características fenotípicas de los individuos; este hecho es de gran importancia a la hora de considerar la creación de las bases de datos genéticas. Para analizar dichos polimorfismos del ADN, los laboratorios de Genética Forense utilizan una serie de técnicas que están en continua evolución, consiguiendo que cada vez la identificación por medio del ADN sea más precisa y rápida.

Los polimorfismos se encuentran en regiones no codificantes del genoma lo cual garantiza que no se alterará el producto de ningún gen. Sin embargo, pueden existir secuencias polimórficas en regiones codificantes (polimorfismos exónicos) que no afectan al producto génico (en su mayoría son polimorfismos donde varía un solo nucleótido) o que afectan al producto generando un fenotipo alterado.

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Son las variaciones en las bases nitrogenadas en el sitio donde una enzima de restricción corta un segmento de ADN. Estas variaciones afectan el tamaño de los fragmentos que resultan del corte. Los RFLP se pueden utilizar como marcadores en la construcción de mapas físicos y de ligamiento.

Se presentan dos dobles hélices de DNA, donde la ubicación de cada sitio reconocido por la EcoRI (GAATTC) se indica mediante una flecha. La molécula de DNA tiene una sola diferencia de pares de bases que cambian la GAATTC central a CAATTC, esta diferencia impide que la EcoRI corte en ese punto:

Las enzima de restricción (o endonucleasas de restricción) son aquellas que pueden reconocer una secuencia característica denucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.

El mecanismo de corte de DNA se realiza a través de la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía (Apareamiento de Watson & Crick).

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.

Las enzimas de restricción que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizómeros

OBJETIVOS

• Entender los principios científicos básicos involucrados en la huella de ADN, fingerprinting.

• Conocer las enzimas de restricción y realizar una reacción de digestión.

• Evaluar las pruebas y ser capaz de analizar e interpretar los datos que se generan en la prueba con claridad y confianza.

MATERIALES Y METODOS

Enzima mix EcoRI/Pstl ADN de la escena del crimen Sistema de electroforesis en gel de agarosa

Puntas de pipetas, 2-200µl ADN del sospechoso 1 con buffer, rehidratado Gel de agarosa

Micro pipetas, 2-200µl ADN del sospechoso 2 con buffer, rehidratado Muestras de ADN digerido

Micro tubos de colores: verde, naranja, azul, rojo, amarillo ADN del sospechoso 3 con buffer, rehidratado Lambda HindIII (marcadores

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