Bioquimica

 Lograr comprender los conceptos y fundamentos de la espectrofotometría.

 Conocer y aplicar la ley de Lambert – Beer.

 Determinar la concentración de una solución por espectrofotometría.

 Establecer los factores que ocasionan desviaciones a la ley de Lambert-Beer.

 Aplicación de las mediciones espectrofotométricas para la valoración de parámetros.

 Establecer la relación entre la transmitancia y absorbancia con la concentración.

La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe o transmite un sistema químico en función de la longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y bioquímicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

En la espectrofotometría es aprovechada la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica es medida la cantidad de luz absorbida como una función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben cierto intervalo de longitudes de onda de la luz visible y transmite o refleja el color complementario que no ha sido alterado. Así, en el análisis colorimétrico de un material que añada un color rojo a un disolvente es porque la variación de la absorbancia con la concentración, será máxima en la región verde del espectro, mientras que el cambio de absorbancia con la radiación roja será mínimo.

La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV de 180 a 380nm. y en el de la luz visible de 380 a 780nm., por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

 LEY DE BEER:

La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución.

Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar disuelta y en otro vaso tenemos la misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azúcar en solución. El detector es una celda fotoeléctrica, y la solución de azúcar es la que se mide en su concentración.

Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.

 Ley de Lambert:

En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz.

Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentración de azúcar, pero, el segundo tiene un diámetro mayor que el otro.

Según la ley de Lambert, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se explicó en la ley de Beer.

 Ley Lambert Bouguer -Beer—Lambert:

Una ley muy importante es la ley de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley Lambert Bouguer y Beer) la cual es solo una combinación de las citadas anteriormente.

MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE ANÁLISIS

1. NATURALEZA DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA:

La Radiación Electromagnética es una forma de Energía radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se define:

A) LONGITUD DE ONDA (L): Es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, según el S.I. en nanómetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.

B) FRECUENCIA (N): Es el número de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su fórmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

C) FOTONES: La luz está formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotón depende de la frecuencia y de la longitud de onda, según la siguiente expresión: E = h x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energía Electromagnética se mide el Ergios. La relación entre la longitud de onda y la Energía es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energía y viceversa.

D) ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO: Cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las más interesantes para nosotros son:

Región Ultravioleta: l = 10-380 nm

Región Visible: l = 380-780 nm

Región Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Región Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molécula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y MATERIA:

A) FENÓMENO DE ABSORCIÓN:

Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partícula en estado excitado. La molécula absorbe la E de la onda y aumenta su energía, y ese aumento de energía es igual a la E de la Radiación Electromagnética absorbida

(E = h.n). La partícula en estado excitado tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.

“Espectro de Absorción”. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de la espectrofotometría

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