Bitacora agrotransformación biotecnología molecular

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Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Práctica Agrotransformación

Presenta:

Morán García Gerardo

Profesores:

Dra. Estela Flores Gómez

Dr. Germán Fernando Gutiérrez Hernández

Fecha de entrega: 12-10-2021

Objetivo General  

• Realizar la inserción de material genético dentro de una célula vegetal a través de Agrobacterium rhizogenes.  

Objetivos específicos  

• Establecer un cultivo  in vitro de semillas de jitomate o chile bajo condiciones asépticas.
•  Entender y desarrollar el mecanismo de Agrotransformación a través de Agrobacterium rhizogenes,  utilizando plántulas de los cultivos in vitro.

1. Investiga ¿Por qué se utiliza Cefotaxima en el protocolo?

Diferentes autores han informado que el uso de cefotaxima en el cultivo in vitro de plantas produce menores efectos fitotóxicos que otros antibióticos y reduce la contaminación bacteriana (Danilova y Dolgikh, 2004; Grewal et al., 2006; Asif et al., 2013; Sabale et al., 2015). Barrueto y Zimmermann (2006) informaron que la adición de Cefotaxima 100 mg l-1 ayudó en el control de contaminación bacteriana persistente sin afectar el crecimiento y coloración de yemas axilares de yuca (Manihot esculenta) cultivadas in vitro. Sin embargo, Sabale et al. (2015) con la incorporación al medio de cultivo de cefotaxima 1000 mg l-1 alcanzaron un control efectivo de la contaminación bacteriana en la micropropagación de banano cv. ‘Grande naine’ (Musa AAA) sin fitotoxicidad. 1

1. ¿Qué otro antibiótico se recomienda para eliminar a Agrobacterium?

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1. ¿Qué características deben cumplir los antibióticos empleados para eliminar a Agrobacterium?

Los antibióticos β-lactámicos son bacteriolíticos, y actúan inhibiendo la síntesis de la barrera de peptidoglicanos de la pared celular de bacterias sensibles. La barrera de peptidoglicanos es importante para la integridad estructural de la pared celular, especialmente para los microorganismos Gram positivos. El paso final de la síntesis de los peptidoglicanos, la transpeptidación, se facilita por unas transpeptidasas conocidas como "penicillin binding proteins" (PBPs, proteínas de anclaje de penicilinas).2 

1. Una vez que obtienes raíces pilosas ¿cómo se propagan in vitro?

ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.3

1. ¿Cuál es la aplicación de estas raíces transformadas?

Para la obtención de metabolitos secundarios en plantas, se han empleado diversos sistemas; sin embargo, uno de los más recomendados es el cultivo de raíces y brotes, ya que estos se caracterizan por tener un patrón metabólico muy similar al de los órganos en la planta y pueden o no haber sido sometido a procesos de transformación genética (8). El uso de la técnica de hairy roots o raíces pilosas busca una mayor producción de raíces adventicias con el fin de aumentar la cantidad de metabolitos secundarios que obtener. Además, se ha demostrado que la transformación de raíces con la bacteria Agrobacterium rhizogenes genera altas respuestas de enraizamiento por parte de la planta, ya que tiene la capacidad de infectar las plantas por medio de heridas e inducir la producción de raíces adventicias.3

1. Leer el artículo Citovsky, traer la figura 1 pegada en la bitácora y el pie de figura traducido paso por paso.

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Resumen de los principales eventos y estructuras moleculares dentro de la célula Agrobacterium que generan la maquinaria de la proteína Vir y las cadenas T que luego se transportan a la célula vegetal, entran en su núcleo y se integran en el genoma. El proceso de transformación comienza con el reconocimiento de las señales de la planta por el sistema sensorial bacteriano VirA / VirG, seguido de la activación de los virus y la unión de la bacteria a la célula huésped. VirD2 / VirD1 escinde la hebra T de la región de ADN-T y se exporta, en cis con una molécula VirD2 unida covalentemente y en trans con varias otras proteínas Vir, al citoplasma de la célula vegetal a través de un sistema de secreción VirB / D4 tipo IV. Dentro de la célula huésped, el conjugado VirD2-cadena T está empaquetado por numerosas moléculas de VirE2 para formar un complejo T maduro. Para una discusión en profundidad sobre el transporte del complejo T y la importación nuclear, y la integración del ADN-T, vea el texto.

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