CARACTERIZACION BIOQUIMICA DE ENTEROBACTERIAS Y BACILOS

CARACTERIZACION BIOQUIMICA DE ENTEROBACTERIAS Y BACILOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD DEL VALLE

OCTUBRE DE 2010

  * Introducción 

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no; para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. 

Para el   caso de la práctica de laboratorio realizada, se empleo Escherichia coli, microorganismo de la familia Enterobacteriaceae, la cual está formada por bacilos gramnegativos aerobios, anaerobios facultativos, no esporulados. Todas las especies son oxidasa negativos, reducen nitratos a nitritos y fermentan glucosa. Pueden ser móviles o inmóviles. Se encuentran en la flora normal del tracto digestivo del hombre y animales.

Son bacterias poco exigentes, sobreviven en el ambiente, contaminan agua y alimentos y crecen en medios de cultivo comunes.

  * Objetivo   general

Aplicar e interpretar las diferentes pruebas bioquímicas a Enterobacterias y Bacilos.

  * Objetivo especifico

Aplicar e interpretar las pruebas bioquímicas aplicadas a una cepa de Escherichia coli.

  * Escherichia coli   en Agar Mc Conkey 

El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminación de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y -). Composición g/l:

- Peptona 20.0: fuente de nitrógeno y carbono para las Lac -.

- Lactosa 10.0: fuente de carbono para las Lac +.

- Sales biliares 2.5: le confiere carácter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +.

- Cloruro sódico 5.0: para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis).

- Rojo neutro 0.05: indicador que va hacer que el medio vire de coloración. Si las bacterias son Lac +, producirán ácidos derivados de la fermentación que darán al medio un aspecto rosáceo; si por el contrario son Lac -, el medio se gasificará por el uso de la peptona y se tornará amarillo.

- Cristal violeta 0.001: interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio.

- Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Imagen 1. Lac +                                             Imagen 2. Lac –

Dado que E. coli   es una bacteria lac +, el agar Mc Conkey se torna de color rosado como resultado de los ácidos derivadosde la fermentación de la lactosa (imagen 1).

Microorganismo | Familia | Tinción | Forma | Movilidad |

  Escherichia coli | Enterobacter | Gram − | Baciloscortos noesporulados | Flagelos perítricos |

  * Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

Es un medio para la diferenciación de Enterobacteriaceae basado en la producción de sulfuro de hidrogeno fermentación   de lactosa, sacarosa y glucosa. 

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.

Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

  * Procedimiento

Posterior a la implementación   de medidas asépticas en el área de trabajo   se realizo una siembra en profundidad y por estriado en superficie de Escherichia coli en el medio   TSI, incubando a 37 oC durante 24 horas. 

  * Resultadosy discusión 

Escherichia coli |

Crecimiento | Crecimiento de bueno a excelente; colonias amarillas, medio amarillo alrededor de las colonias |

Fermentación de lactosa | Positivo |

Fermentación   de glucosa | Positivo |

Producción de de H2S | Negativo |

Medio de cultivo | Acido |

Dada la coloración obtenida después de las 24 horas de incubación, se puede inferir la fermentación de lactosa y glucosa; en el momento de la observación no se precisa la generación de H2S.

  * Prueba de lisina decarboxilasa 

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Losmicroorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta

...