CROMATOGRAFÍA

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2: CROMATOGRAFÍA

Objetivos:

 Conocer e interpretar los principios de separación de cromatografías en columna de filtración en gel y de intercambio iónico.

 Purificar parcialmente la fosfatasa ácida de germen de trigo.

Materiales disponibles:

 Columna de filtración en gel sephadex G-25 (rango de separación 1000 -5000 Da).

 Columna DEAE-celulosa (DE-52)

 Solución de azul dextrano (PM: 2000000 Da, 5 mg/ml) y Cloruro de Cobalto (10 mg/ml)

 Solución de hemoglobina (5 mg/ml)

 Extracto de germen de trigo obtenido en el TP N º 1

 Buffer A: Tris-HCl 50 mM pH 8

 Buffer B: NaCl 0.5 M en buffer A.

 Buffer C: Acetato de Na 50 mM pH 4.

 Buffer D: Acetato de Na 50 mM pH 4 + 0.5 M NaCl.

 Buffer acetato de sodio 0.2 M pH 5

 Sustrato de la fosfatasa acida: para-nitro fenol fosfato (pNPP) 25 mM

 KOH 0,1 N

 Tubos de ensayo, placas de ELISA

Preparación de las columnas:

Antes de comenzar el TP se deberá equilibrar la columna en buffer y regular el flujo de la misma hasta alcanzar 1 ml/min aproximadamente.

Buffer A para filtración en gel, buffers A y C para los intercambiadores iónicos

ACTIVIDADES

1) a) Cromatografia de intercambio iônico

1-Sembrar 0,2 ml de la solución de hemoglobina en las columnas de DEAE-celulosa equilibradas en los buffers A o C.

2-Lavar las columnas con el mismo buffer en que fueron equilibradas (aprox 15 ml). Colectar fracciones de 1.5 ml. Luego del lavado cerrar el flujo de la columna.

3-Medir absorbancia a 280 nm cada dos tubos.

4-Realizar las eluciones de las columnas cromatográficas con la/s fase/s moviles seleccionadas (B o D), en las mismas condiciones en las que se realizó el lavado.

5- Medir absorbancia a 280 nm de todos los tubos.

1) b) Purificación parcial de Fosfatasa ácida

Sembrar 0.2 ml de solución de extracto de germen de trigo en la columna DEAE-celulosa equilibrada en el buffer A o C. Lavar con 15 ml de buffer A y eluir con 15 ml de buffer B o D, según corresponda. Colectar fracciones de 1.5 ml. Medir absorbancia a 280 nm de todos los tubos. Determinar en cada fracción la presencia o ausencia de actividad de fosfatasa ácida en los tubos pares.

Determinación de la actividad de fosfatasa ácida

Reacción enzimática de la fosfatasa ácida

PNPP + Enzima-------pNP (Incoloro)

pNP +KOH (Amarillo)

pNPP

+ KOH

pNP (amarillo intenso)

-Determinar en las fracciones recogidas si tiene (+) o no (-) actividad enzimática. Proceder como sigue:

En una placa de ELISA colocar en cada pocillo:

20 μl de la fracción (fracción por medio) + 20 µl de buffer acetato pH 5 + 20 µl de pNPP (diluido 1/5)

-Incubar a 37 ºC durante 30-45 min. Una vez finalizado el tiempo de incubación agregar a cada posillo: 140 µl de KOH 0.1 N.

Anotar el resultado: Reacción (+): amarillo intenso. Reacción (-): incolora o amarillo suave.

Realizar

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