CULTIVOS DE MICROORGANISMOS

IMFORME DE LABORATORIO Nº4

TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS

1. Introducción

Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que, en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación, la luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto.

Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta.

1. Objetivo

• Conocer las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivos sólidos para la obtención de cultivos puros de bacterias.
• Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.

1. Materiales y métodos

• EJERCICIO 1. “Técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento en placas”

• Objetivo.
• Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando técnicas de aislamiento.

1. Materiales.

• Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Serratia marceasen, Bacillus sp., Escherichia coli, Mlcrococcus sp., Proteos sp.)
• Asa de Kolle, aguja de Kolle
• Mechero
• Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50° C.
• Placas Petri estériles
•  Placas con agar nutritivo
• Placas con Agar Mac Conkey

1. Aislamiento por estrías

1. Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa o aguja de Kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia.
2. Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos pulgar e índice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la placa, así evitara mayor contaminación. Con el asa cargada de inoculo, haga estrías sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una última estría en un espacio libre. Cierre la placa.
3. Esterilice el asa a la llama nuevamente.
4. Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.
5. Coloque las places en incubaci6n a 37° C por 24 horas.
6. Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus características de forma, elevación, consistencia, bordes, etc. Diferencie las características de las colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

[pic 1]

Figura 2. Aislamiento por estrías.

1. Aislamiento por diluciones

1. Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa de Kolle retire inoculo.
2. Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50° C y transfiera as6pticamente el inoculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado mezcle el inoculo con el medio, haci6ndolo girar entre las palmas de las manos.
3. Transfiera una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Repita la operación anterior para obtener una mezcla homogénea.
4. Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri est6riles y rótelas lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique cada dilución.
5. Incube las placas a 37° C por 24 horas.
6. Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Haga un recuento de colonias, si el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las características diferenciales de las colonias observadas.

[pic 2]

Figura 3. Aislamiento por diluciones.

• EJERCICIO 2. “Técnicas de Cultivo de Microorganismos: Características de crecimiento en medio de cultivo.”

• Objetivo

• Observar las características de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo líquido y sólido.

1. Materiales

• Cultivo de Microorganismos de 18 horas.
• Asa de Kolle.
• Mechero.
• Tubos con agar nutritivo inclinado.
• Tubos con agar nutritivo vertical.
• Tubos con caldo nutritivo.

1. Método

• Técnica de cultivo de microorganismos

1. Esterilice el asa de Kolle por flameo a la llama.
2. Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al mechero y obtenga una pequeña porción del cultivo con ayuda del asa de Kolle. Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.
3. Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores introduzca el asa en el líquido para dejar el inóculo. Homogenice la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.
4. Repita el procedimiento 1 para obtener m6s in6culo, pero usando esta vez aguja de Kolle.
5. Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inóculo a lo largo de una sola línea descrita desde la base de la inclinaci6n hasta el extremo.
6. Repita el procedimiento 1 para obtener inóculo, usando nuevamente aguja de Kolle.
7. Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda del medio.
8. Rotule los tubos sembrados y póngalos a incubar a 37° C por 24 horas.
9. Cumplido el tiempo de incubación, evalué el crecimiento y anoté sus resultados en la hoja adjunta, según lo siguiente:

1. Resultados

1. Discusión y conclusiones

En este experimento se pudo realizar la siembra por estrías y dilución, en la cual dio como resultado la formación de colonias sobre las placas de agar nutritivo. Las colonias se formaron durante un tiempo de incubación de 24 a 48 horas.

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