Corrección genética dirigida de células madre hematopoyéticas humanas para el tratamiento del síndrome de Wiskott-Aldrich

Corrección genética dirigida de células madre hematopoyéticas humanas para el tratamiento del síndrome de Wiskott-Aldrich

El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una inmunodeficiencia primaria ligada al cromosoma X con anomalías plaquetarias graves e inmunodeficiencia compleja. Aquí mostramos que una estrategia de edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 permite la corrección precisa de mutaciones WAS en hasta el 60% de las células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas (HSPC), sin afectar la viabilidad celular y el potencial de diferenciación. La entrega de los reactivos de edición a WAS HSPC condujo al rescate completo de la expresión de WASp y a la corrección de defectos funcionales en células mieloides y linfoides. El trasplante primario y secundario de WAS HSPC corregidas en ratones inmunodeficientes mostró la persistencia de las células editadas durante hasta 26 semanas y la focalización eficiente de las células madre repoblantes a largo plazo. Finalmente, no se asoció ninguna genotoxicidad importante con el proceso de edición de genes, allanando el camino para una terapia alternativa, pero altamente eficiente y segura.

Introducción

El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es una enfermedad de inmunodeficiencia primaria recesiva ligada al cromosoma X que se caracteriza por microtrombocitopenia, infección recurrente e inmunodeficiencia compleja. El WAS es causado por mutaciones en el gen WAS, que conducen a una expresión o función defectuosa de la proteína WAS (WASp) . WASp es un regulador del citoesqueleto de actina y su deficiencia interrumpe muchos procesos dependientes. Sin un tratamiento definitivo, el pronóstico de los pacientes clásicos diagnosticados de WAS sigue siendo pobre .

WASp se expresa ampliamente en células hematopoyéticas y, en consecuencia, la corrección completa de WAS requiere la restauración de la expresión de WASp en casi todos los linajes hematopoyéticos. El trasplante de células madre hematopoyéticas (TCMH) es muy eficaz, pero el aumento de la morbilidad y la mortalidad asociadas con el TCMH de donantes no compatibles han impulsado la búsqueda de enfoques terapéuticos alternativos. La adición de genes basados en vectores virales reduce el riesgo de alorreactividad al tiempo que proporciona una opción curativa para todos los pacientes. Tras el desarrollo de mutagénesis insercional en pacientes WAS tratados con un vector γ-retroviral , los ensayos clínicos posteriores de terapia génica han utilizado un vector lentiviral (LV) autoactivante con un fragmento de 1,6 kb del promotor WAS endógeno para regular la expresión de WASp  . Los pacientes tratados con este VI han mostrado una mejoría clínica sustancial, con una menor frecuencia de hemorragias y episodios de infección y resolución del eccema. Sin embargo, a pesar de la corrección sólida de las anomalías de los linfocitos T, la corrección de otros linajes (plaquetas en particular) ha resultado más desafiante, lo que refleja una deficiencia en la construcción del vector para la expresión génica fisiológica recíproca. Además, los vectores lentivirales conllevan un riesgo potencial intrínseco de genotoxicidad debido a su patrón de integración semi-aleatorio.

La edición de genes es una alternativa a la terapia de adición de genes convencional y puede superar algunas de sus limitaciones. La integración mediada por reparación dirigida por homología (HDR) de un transgén de ADNc en secuencias específicas ofrece mucho más control sobre la integración del sitio del vector viral y el número de copias; además, el knock-in dirigido de un ADNc en su locus endógeno mejora la probabilidad de expresión génica regulada fisiológicamente. Estudios recientes han demostrado la viabilidad de esta estrategia para abordar las inmunodeficiencias primarias. Aquí, hemos desarrollado una plataforma de edición de genes CRISPR / Cas9 para incorporar un WAS terapéuticoADNc en marco con su codón de inicio de traducción endógeno en células madre y progenitoras hematopoyéticas derivadas del paciente (HSPC), lo que permite regulaciones transcripcionales de las regiones reguladoras WAS . Como WAS surge de> 300 mutaciones genéticas esparcidas por todo el gen WAS , esta estrategia asegura la corrección de todas las mutaciones conocidas que causan enfermedades

Resultados

Edición mediada por CRISPR / Cas9 del locus WAS en HSPC

Para mediar en la integración específica del sitio de un ADNc de WAS en el locus genómico de WAS (Fig. 1a) diseñamos diferentes ARNg dirigidos al primer exón del gen WAS y probamos su actividad en células K562. Se consiguieron tasas de rotura alélica (formación de indeles) de hasta el 45% (32,3 ± 12,5) con gRNA-1, que se seleccionó para todos los experimentos posteriores (Fig. 1A, B complementaria  ). El suministro del ARNg precomplejado con la proteína Cas9 como ribonucleoproteínas (RNP) a las HSPC CD34 + derivadas de sangre periférica (PB) de donantes sanos produjo hasta un 90% (78,1 ± 7,9) de formación de indeles, con la mayor frecuencia de alteración alélica que se logra cuando se usa una combinación de ARNg 18 modificado químicamente y la versión de alta fidelidad (HiFi) de Cas9 19 (Fig. 1c, Fig. Complementaria  1C-F ).

La rotura alelica rompe las cadenas de ADN para generar la mutación y que intervenga la maquinaria de crispr cas9, la ruptura fue eficiente. Se genero en HSPC CD34 + derivadas de sangre periférica (PB) de donantes sanos

 La corrección de la ruptura genómica mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ) condujo a la inserción de 1 par de bases o la eliminación de 4 pares de bases aguas arriba del codón de inicio WAS en la mayoría de las HSPC, sin alteración de la secuencia codificante de WAS ( Fig.1D, E complementaria).  ). Para entregar la molécula de ADN del donante que sirve como plantilla para la reparación mediada por HDR(recombinación homóloga es un tipo de recombinación genética en la que las secuencias de nucleótidos se intercambian entre dos moléculas similares o idénticas de ADN. ), creamos un vector AAV6 que contiene un templado indicador de GFP(   La proteína verde fluorescente  ) flanqueado a cada lado por secuencias con homología con las regiones WAS que rodean el sitio de corte del gRNA (Fig. 1c). Mediante electroporación de RNP(ribonucleoproteína), seguida de transducción con el vector donante AAV6, observamos la integración dirigida del casete informador PGK-GFP en hasta el 69% de las HSPC (52,1% ± 10,9), sin una disminución significativa en la viabilidad celular en comparación con el modelo de objetivo simulado HSPC (Fig. 1d, e; Fig. Complementaria  1G ). La ampliación del protocolo de edición de genes optimizado para la preparación clínica utilizando un electroporador de grado clínico produjo tasas de integración dirigida similares o superiores a las observadas a pequeña escala, al tiempo que se conserva la viabilidad celular (Fig. 1f, g)

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