DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y ANÁLISIS DE PARÁMETROS CINÉTICOS DEL CULTIVO DE Ralstonia eutropha UTILIZANDO COMO SUSTRATO HIDROLIZADO DE HARINA YUCA

DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y ANÁLISIS DE PARÁMETROS CINÉTICOS DEL CULTIVO DE Ralstonia eutropha UTILIZANDO COMO SUSTRATO HIDROLIZADO DE HARINA YUCA

INTRODUCCIÓN

La evaluación de parámetros cinéticos resulta ser fundamental para entender y definir el comportamiento característico del crecimiento o supervivencia de un microorganismo1  en un medio de cultivo, siendo herramientas esenciales para el desarrollo de procesos biotecnológicos llevados a cabo en el laboratorio,  de tal forma que se permita predecir el desarrollo y obtención de diferentes metabolitos y valorar los rendimientos y productividades2 en dichos procesos, con el fin determinar las mejores condiciones para cultivar a un microorganismo de interés industrial.

Uno de los metabolitos de mayor interés industrial sintetizados por algunos géneros bacterianos, como materiales de almacenamiento de carbono, son los poli-hidroxialcanoatos (PHAs), utilizados como candidatos para sustituir polímeros de origen petroquímico4, debido a su fácil obtención; Rasltonia eutropha es el microorganismo más investigado para la obtención de este tipo de metabolitos, debido a su capacidad de acumular4 en cantidades considerables polímeros como los PHAs. Dicho microorganismo, bacilo Gram-negativo, puede sintetizar y acumular estos biopolímeros en medios simples utilizando fuentes de carbono económicas, como glucosa, fructosa e incluso residuos de la industria oleica o agro-industriales4,5 que puedan garantizar su crecimiento y supervivencia, además de generar buenos desempeños en los rendimientos productivos del metabolito de interés.

METODOLOGÍA

Preparación del medio de cultivo

• Calculo de las concentraciones de los componentes (sales) del medio de cultivo

Se estableció la cantidad en gramos de cada uno de los componentes que se adicionaron al medio a partir de los 50 ml (volumen final) de las soluciones madre, de forma que se estableció una regla de tres para calcular la cantidad de las sales del medio como se muestra en la ecuación 1.

[pic 1]

Donde,  es el volumen equivalente a la concentración de las sales;  es el volumen final de las soluciones madre;  es la incógnita o la concentración de sales que es necesario pesar en 50 ml de la solución madre. [pic 2][pic 3][pic 4]

Al despejar de la ecuación la incógnita  se obtuvo la ecuación 2:[pic 5]

[pic 6]

Al reemplazar los valores de la concentración de las sales en la ecuación 2 se estableció la cantidad de sales en gramos que contenían las soluciones madre.

Ejemplo de la concentración de MgSO4 ∙ 7H2O donde la concentración de sal inicial fue de 20g/L:

[pic 7]

• Volumen de glucosa requerido para la preparación del medio de cultivo

Se determinó el volumen de azúcar requerido para la preparación del cultivo 3 sabiendo que el hidrolizado de harina de yuca tenía una concentración inicial de 196g/L y se quería llegar a una concentración de 20g/L en un volumen final del cultivo de 100 mL; de forma que se estableció a partir de la Ecuación 1:

        [pic 8][pic 9]

Protocolo de a preparación del medio de cultivo

A partir de las concentraciones y volúmenes establecidos se realizó la preparación de las soluciones madre en tubos falcon de 50 mL, donde se mezcló los gramos pesados de cada una de las sales con 50mL de agua destilada y fueron esterilizados en autoclave; además se realizó la preparación de 100mL de la solución de glucosa adicionando 10,2mL del hidrolizado de harina de yuca en un Erlenmeyer de 250mL y se adicionó 75,8mL de agua destilada el Erlenmeyer se cubrió con papel aluminio y tapado con gasa y algodón. Se realizó la preparación la preparación de 50mL del medio de cultivo TSB en un Erlenmeyer de 150 mL y se llevó a esterilizar.

Siembra del inóculo y fermentación

Se realizó el inóculo del Ralstonia eutropha  en un medio TSB que posteriormente fue incubado a 30°C por 12 h a 150 rpm. Luego del periodo de incubación se adicionó al medio de cultivo inoculado la fuente de carbono y los elementos traza previamente preparados y con las concentraciones específicas para el cultivo 3.  Se tomó 1,5 mL de esta solución en el tiempo 0, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas de cultivo en condiciones de asépticas y se incubaron a 4°C; además se tomó 1,5 ml del medio de cultivo inoculado en el tiempo 0 y se transfirió a un vial el cual funcionó como blanco en todo el experimento, este fue incuba a 4°C.

Análisis de muestras

• Determinación de la biomasa

A parir de cada uno de los viales incubados se tomó un volumen y se transfirió a celdas de plástico y se realizó un análisis del cultivo, en cada tiempo establecido anteriormente, por espectrofotometría a 600nm, obteniendo datos de densidad óptica D.O y con esta se estableció la concentración de biomasa en cada tiempo de cultivo a partir de la curva estándar de D.O. vs peso seco  y se realizó un análisis gráfico en Excel de los datos obtenidos.[pic 10]

• Mediciones de azúcares reductores

La medición de azúcares reductores se realizó por duplicado donde las muestras diluidas en el rango de 0,04-0,4g/L de cada tiempo de cultivo fueron procesadas por el método DNS; las muestras fueron analizadas por espectrofotometría a 540nm obteniendo datos de D.O. que posteriormente fueron procesados a través de la curva estándar de ABS vs Glucosa  y analizadas a través de gráficos.[pic 11]

• Identificación presuntiva de la acumulación de PHA

Se realizó un frotis de bacteriano de cada una de las muestras que posteriormente fueron teñidos con sudan Black B. y analizados por microscopía óptica en 100x, a partir de la observación de las placas se estableció un porcentaje de PHA acumulado por R. eutropha en cada tiempo de cultivo.

Análisis de datos

• Determinación de la concentración de biomasa

La concentración de biomasa se determinó a partir de la curva estándar:

[pic 12]

Donde,  es la D.O. o ABS a 600nm,  es concentración de biomasa,  es la pendiente y  es el intercepto. [pic 13][pic 14][pic 15][pic 16]

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