Determinación De La Actividad De Enzimas Proteoliticas método De Kunitz

PRACTICA 4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.

MÉTODO DE KUNITZ

FUNDAMENTO.

El método de kunitz se emplea para la determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas, el cual se basa en medir la cantidad de péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis de la caseína por proteínas proteolíticas (bromelaína y papaína) aprovechando la capacidad, de ciertos de ellos y puedan absorber selectivamente a 280 nm.

OBJETIVOS

Elaborar una curva estándar de actividad enzimática

Determinar la actividad proteolítica de la bromelaína, la papaína y otras proteasas.

RESULTADOS

Tabla 1. Absorbencia a 280 nm de tripsina a diferentes concentraciones así como de bromelaína y papaína.

Tubo Conc. De tripsina mg/ml A 280 A 280 Corregida

PROBLEMA TESTIGO

T1 Y 1 0.04 0.299 0.167 0.132

T2 Y 2 0.08 0.409 0.175 0.234

T3 Y 3 0.12 0.528 0.177 0.351

T4 Y 4 0.16 0.614 0.160 0.454

T5 Y 5 0.20 0.705 0.206 0.499

PROBLEMAS

TI Y I Bromelaína 1:10 0.863 0.295 0.568

TII Y II Bromelaína 1:20 0.490 0.250 0.240

TII Y III Papaína 0.210 0.174 0.036

a) ¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina?

[UT]mg=m/(tiempo (20 m))

[UT]=(2.385)/(20 min) =0.119 UT/mg

Tabla 2. Actividad enzimática especifica para la digestión de caseína por tripsina.

Tubo UT A 280 corregida

1 0.00476 0.132

2 0.00952 0.234

3 0.01428 0.351

4 0.01904 0.454

5 0.02380 0.499

a) indique la actividad específica, en UT por gramo de muestra, de la piña (bromelaína) y el ablandador de carne (papaína).

15 g de piña ---- 18 mL de sol. Reg.

0.83 g de piña---- 1 mL

Y=mx+b

X=y-b/m

Bromelaína 1:10

X=(0.568)-(0.0478)/20.042

X=0.02595 UT (10) =.2595

0.2595 UT ----- 0.83g/mL

0. 0.3126 UT ----- 1 g/mL

Bromelaína 1:20

X=(.240)-(0.0478)/20.042

X=0.00958 UT (20) =0.1916

0.1916 UT ---- 0.83 g/mL

0.2308 UT ---- 1 g/mL

1 g de ablandador de carne ----- 15 ml de sol. Reg.

0.06 g de ablandador de carne --- 1 ml

Papaína

X=(0.036)-(0.0478)/20.042

X= -0.000488 UT

-0.000488 UT ---- 0.06 g/mL

-0.008133 UT --- 1 g/mL

PREGUNTAS

a) Defina:

Actividad enzimática: Relación entre la actividad enzimática y la cantidad de proteína. Proporciona información sobre las velocidades de reacción, miden también la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores, y proporcionan conocimientos sobre los mecanismos de reacción.

Actividad enzimática especifica: La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/mL). Es el número de unidades de enzima por mg de proteína.

b) Escriba la clasificación de las proteasas, en función de su mecanismo de acción y diga en que grupo se ubican las determinadas en la práctica.

Se clasifican por su modo de acción catalítica (endo- o exo-actividad) o con base en su sitio catalítico. Las endoproteasas hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos. La naturaleza del centro catalítico de las proteasas difiere de acuerdo con los aminoácidos y otros ligandos que intervienen en la formación del complejo enzima-sustrato.

El centro activo contiene aminoácidos o bien cationes metálicos que promueven la catálisis, denominándose serinproteasas, cisteinproteasas, aspartato proteasas, según intervengan los aminoácidos serina, cisteína o ácido aspártico. En las metalo-proteasas la

actividad está promovida por un catión metálico, siendo el más frecuente el zínc. Todas las serinproteasas tienen actividad endo. Contrariamente, las metalo- proteasas son sobre todo exo-proteasas.

De acuerdo a su mecanismo catalítico las proteasas se clasifican en:

a) Serin proteasas: poseen un residuo de serina en su sitio activo y son inhibidas específicamente por diisopropoil-flourofosforo y otros

...