Determinación de la actividad Enzimática

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PRÁCTICA #2

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA “ACTIVIDAD ENZIMÁTICA”

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Nombre la asignatura:

Bioquímica Microbiana

Nombre de la Unidad de Aprendizaje:

Enzimas

Nombre de la práctica o proyecto:

"Determinación de la actividad Enzimática"

Número:

2/5

Duración (horas)

2 horas

Resultado de aprendizaje:

Cuantificar la  actividad de una extracto crudo enzimático sobre una molécula de azúcar.

Requerimientos (Material o equipo):

Material de laboratorio:

Tubos ependorf, tubos de ensayo

Termómetros.

Vaso de ppdo. 250 ml.

Gradillas.

Matraz Erlenmeyer 250

Pipetas  1ml, 5ml, 10ml.

Celdas.

Espátula

Vortex

Vidrio de Reloj

Baño de hielo

Equipo:

Mechero con tripié.

Espectofotómetro

Microcentrífuga

Cronómetro

Incubadora

Material biológico:

Enzima Levadura de panificación

Reactivos:

Agua destilada

Sustrato (Solución de sacarosa 0.5 M en buffer de acetatos 0.1 M pH 5.3)

Reactivo A (Anexo 1)

Reactivo B (Anexo 1)

Reactivo C (Anexo 1)

Reactivo de DNS (Anexo 2)  

Actividades a desarrollar en la práctica:

Se pueden realizar diversas técnicas que demuestren el resultado de aprendizaje, la aplicación de cualquiera de ellas dependerá del equipo de laboratorio disponible en la Universidad o de la facilidad de vinculación con algún laboratorio externo.

Para realización de esta práctica es necesario contar con: una fuente de la enzima  (comprada u obtenida de algún producto natural, puede ser  invertasa, amilasa, catalasa, papaína, bromelina, etc.) y una técnica para la determinación de la actividad enzimática.

Como sugerencia se anexa la siguiente práctica:

“Actividad enzimática ”.

La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad, las condiciones y mecanismos de una reacción catalizada por una enzima.

La enzima invertasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa dando como producto glucosa y fructosa. Frecuentemente a esta reacción se denomina inversión. La invertasa se puede conseguir de células de levadura.

La actividad enzimática se pone de manifiesto incubando el sustrato juntamente con la enzima y posteriormente se detiene la reacción y se mide colorimétricamente la reducción del ácido 3,5−dinitrosalicílico que es lo que determina la velocidad de la reacción. Se basa en que la sacarosa no contiene átomo de carbono anomérico libre y por lo tanto no es un azúcar reductor.

La invertasa es una de las enzimas más conocidas y fue la primera cuya cinética enzimática se estudió en profundidad por Michaelis-Menten, además de que posee gran importancia a nivel industrial.

Procedimiento

Para determinar la actividad enzimática de invertasa el extracto enzimático se obtendrá de la levadura Saccharomyces cerevisiae en el proceso de panificación.

1.- Pesar 1 g de levadura seca y añadir a 10 ml de agua destilada tibia a 37ºC.

2.- Homogenizar y colocar en tubos ependorf 2 ml de esta solución.

3.- Centrifugar a 5000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante será considerado como el extracto crudo enzimático, y será utilizado para la cuantificación de la actividad.

1. Organizar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla.

4. El tubo 1 no se incuba e inmediatamente se agrega 1 ml de DNS.

5. Los tubos 2, 3 y 4 se incuban durante 5 min a 37ºC. para que la enzima lleve a cabo la reacción, posteriormente se retiran y se agrega 1 ml de DNS.

6. Todos los tubos que contienen DNS se colocan en agua en ebullición por 5 minutos, se dejan enfriar para su lectura.

7. Leer en espectrofotómetro a 575 nm calibrando con el tubo 1.

Utilizando la ecuación de la recta de la curva tipo de glucosa, determinar los microgramos de glucosa liberados y con estos datos calcular la actividad enzimática considerando que una Unidad de invertasa como la cantidad de enzima necesaria para liberar un micromol de glucosa por minuto bajo las condiciones de ensayo descritas.

Cálculo la actividad específica

Determinar la concentración de proteína en el extracto crudo enzimático de acuerdo al siguiente procedimiento:

1. Preparar una serie de tubos de vidrio como se describe a continuación.

2. Agregar 1 mL del reactivo A + B en una relación 1:100, agitar vigorosamente en el Vortex e incubar 15 min a temperatura ambiente.

3. Agregar 0.1 mL del reactivo C, agitar vigorosamente en el Vortex e incubar 30 min a 37°C en obscuridad.

4. Leer en espectrofotómetro a 660 nm calibrando con el tubo 1.

5. Utilizando la ecuación de la recta de la curva tipo de proteína, determinar los miligramos contenidos en el ECE.

Análisis de resultados

Calcular la actividad específica de la enzima dividiendo la actividad volumétrica de la enzima entre los mg de proteína.

Discutir los resultados.

Bibliografía.

1.- Horton, H. R. (2008). Principios de Bioquímica. 4ª edición. México: Ediciones Person Education. 129-154 p.

2.- Melo, V., Cuamatzi O. (2006). Bioquímica de Los Procesos Metabólicos. México: Ediciones Reverté. 103-115 p.

3.- Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem. 31(3), 426-428.

Con los resultados el alumno integrara un reporte detallado donde incluirá: objetivo de la práctica, fundamento, metodología, equipo, material y reactivos utilizados, observaciones esquemas y gráfica de actividad enzimática contra temperatura, conclusión y bibliografía.

Evidencias a las que contribuye el desarrollo de la práctica:

ED1: Buenas prácticas de laboratorio "Efecto de los factores que afectan la actividad y la velocidad enzimática"

EP2: Reporte de práctica de laboratorio "Efecto de los factores que afectan la actividad y la velocidad enzimática"