ENDOTOXINAS BACTERIANAS

UNIVERSIDAD PRIVADA NORBERT WIENER

PROGRAMA ACADÉMICO DE ESTUDIOS GENERALES

CURSO: CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS MEDICAMENTOS

Trabajo de Investigación:

ENDOTOXINAS BACTERIANAS – METODO TURBIDIMETRICO

Autores:

• DIAZ FERNANDEZ, MARTHA

• RIVEROS SILVA , MARIBEL

• ZACARIA INCISO.FLOR

• ZEGARRA CEBRIAN,CESAR

LIMA - PERÚ

2014

INDICE

INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 3

MARCO TEÓRICO…………………………………………………………………. 4

HISTORIA

Aparición del LAL en la industria Farmacéutica……………………………………….5

Sustitución de método Pirógeno al método LAL………………………………........... 6

ENSAYO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS………………………………………………………………...…….7

Materiales y reactivos………………………………………………………………... 8

METODO TURBIDIMETRICO……………………………………………………... 9

Ley de Beer-Lambert…………………………………………………………………. 9

TEST DE LISADO DE AMEBOCITOS DE LIMULUS

USANDO EL MÉTODO TURBIDIMETRICO………………………………...........11

PROCEDIMIENTO…………………………………………………………………..13

ESQUEMA DE TRABAJO………………………………………………………….. 14

BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………….. 15

INTRODUCCIÓN

Las endotoxinas solamente las producen las bacterias Gram negativas que poseen una membrana externa , parcialmente constituida por lipopolisacaridos (LPS),una molécula hibrida que contiene al lípido A en un extremo de la misma y a la cadena polisacárido en el otro, a esta molécula se le conoce como ENDOTOXINA.

La mayor parte de la toxicidad se debe al lípido A, todas las bacterias Gram negativas producen endotoxinas, incluso aquellas que producen otro tipo de toxinas.

La endotoxina ejerce una variedad realmente asombrosa de efectos tóxicos en el cuerpo humano: fiebre, aumento o descenso en el número de leucocitos, diarreas, shock, abatimiento (debilidad externa) y muerte. Estos efectos tóxicos se producen cuando la endotoxina estimula ciertas células humanas para que secreten determinadas proteínas mensajeras; así la fiebre se produce cuando la endotoxina estimula los glóbulos blancos para que produzcan una proteína llamada interleucina-1.

El shock endotoxico o séptico (un tipo de shock o perdida grave de presión sanguínea) se produce cuando la endotoxina provoca que los fagocitos secreten una proteína denominada factor necrotizante tumoral, que causa la perdida de líquidos de la circulación sanguínea. Ello hace que no llegue la cantidad suficiente de sangre a los órganos vitales y, como resultado de todo ello, estos se colapsen, provocando una posible situación grave.

Las endotoxinas se distinguen de las exotoxinas en varios aspectos. La endotoxina es un componente común en la estructura de las células Gram negativas y, por lo tanto, solo es liberada al medio externo una vez que las bacterias mueren. Puesto que las endotoxinas a diferencia de las exotoxinas, no tienen naturaleza proteica, son relativamente termoestables y tampoco estimulan el sistema inmunitario para que se produzcan anticuerpos específicos. Quizás la diferencia más importante radique en que las endotoxinas no son específicas, ya que es la misma para todos los patógenos Gram negativos y además su acción es inespecífica, afectando a una gran cantidad de células humanas.

Las endotoxinas no son muy potentes; las que se producen en las infecciones por bacterias Gram negativas desempeñan en general, un papel secundario en la patogénesis de la bacteria. 1

MARCO TEÒRICO

El reactivo LAL

La historia del descubrimiento del reactivo LAL comienza en 1956, cuando el doctor Frederick B. Bang reporta la muerte por coagulación intravascular en el cangrejo herradura americano Limulus polyphemus. Bang, junto a Jack Levin, revela en 1964 que las endotoxinas son el vector causante de la coagulación de la hemolinfa del Limulus. Cuatro años más tarde, estos investigadores comprueban que los elementos responsables de la coagulación inducida por endotoxinas son de naturaleza enzimática, y se encuentran dentro de los amebocitos, único tipo de células presentes en la hemolinfa azul de los cangrejos herraduras. Por lo tanto, el reactivo LAL es un extracto acuoso de los amebocitos, compuesto por una cascada de enzimas serino proteasas tipo tripsina capaz de reaccionar frente a pequeñas cantidades de endotoxinas. La bioquímica de la reacción del LAL se conoce en detalle y el mecanismo en cascada parece ser el responsable de su extraordinaria sensibilidad.

Además del Limulus el cual habita en algunos puntos de la costa del Atlántico de los Estados Unidos hasta el Golfo de México, existen otras 3 especies de cangrejos herraduras oriundos del continente asiático: el Tachypleus tridentatus, el Carcinoscorpius rotundicauda y el Tachypleus gigas. Estos animales son artrópodos marinos muy conocidos por su récord fósil debido a que evolucionaron muy poco en los últimos 300 millones de años.

FIG.1. Representación de la reacción en cascada entre el LAL (enzimas proteolíticas tipo tripsina) frente a las endotoxinas y las ß-(1-3) glucanas según el modelo actual. 2

HISTORIA

Aparición del LAL en la industria farmacéutica

En tanto que el ensayo de pirógenos en conejos es capaz de detectar cualquier sustancia pirogénica, el ensayo del LAL solo detecta endotoxinas. Las endotoxinas son compuestos químicos complejos que se encuentran exclusivamente en la membrana externa de la pared celular de las bacterias Gram negativas.

Este aspecto a primera vista es, sin lugar a dudas, una desventaja para la implementación del ensayo en la liberación de producto terminado. Sin embargo, los primeros defensores de la aplicación del LAL en la industria farmacéutica plantearon que esta característica no era un inconveniente

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