MUTAGENESIS BACTERIANA

INDICE

Página

Introducción y observaciones preliminares 1

Material por pareja 2

Medios de cultivo 3

Esterilización 4

Siembra de microorganismos 5

Fermentación de azúcares 6

Observación de las bacterias 6

Ensayos bioquímicos estandarizados 8

Antibiosis 9

Actividad catalasa 11

Análisis microbiológico de aguas contaminadas 11

Transferencia genética entre bacterias Gram negativas

Conjugación 13

Transformación 14

Titulación de un virus bacteriano y Transducción 15

Crecimiento bacteriano 17

Aislamiento de bacterias lácticas y producción de yogur 18

OBJETIVOS

El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la observación experimental de los conceptos aprendidos durante las clases de teoría.

NORMAS DE SEGURIDAD

Aunque los microorganismos que vamos a manejar no son patógenos habituales, su ingestión masiva o el contacto con heridas puede provocar diversos problemas. Por ello hay que seguir unas cuantas normas de seguridad:

1) No se puede fumar ni comer en el laboratorio

2) Es obligatorio la utilización de la bata

3) La ropa y los objetos personales no deben mantenerse cerca de las zonas de trabajo

4) Al comenzar las prácticas conviene colocar un papel de filtro sobre la zona de manipulación, y retirarlo al terminar el día.

5) Lavarse las manos cuidadosamente antes de salir del laboratorio

CALIFICACIÓN

Cada alumno deberá completar un cuaderno donde anotará con detalle los fundamentos de la práctica correspondiente, los resultados obtenidos y la explicación de éstos.

ORGANIZACION

Las prácticas se desarrollarán por parejas en dos periodos de una semana cada uno. El programa diario que se describe a continuación puede ser sujeto a modificaciones dependiendo del calendario concreto de cada grupo.

Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes

SEMANA 1

Preparación de medios de Cultivo

Siembra

Siembra Antib.

OMac.

OMic.I

Siembra API

Antib.

OMicII

Rdo. API

Rdo. antib.

Catalasa

Rdo.BacProb

Siembra Yogur

SEMANA 2

AnAguasI

Conjug. I

Transformación I

Inoculación Leche

AnAguasII

Conjug.II

TransformaciónII

AnYogur

AnAguas III

Rdo. Conjug.

Rdo. Transf.

TVirus

Transduc.

Rdo TVirus

Rdo. Transduc.

CrecBact.

SEMINARIO

Abreviaturas. An.AguasI, II, III, Rdo.) Análisis de aguas y resultados; Antib.) Antibiosis; Rdo.Antib) Resultado antibiosis; Conjug.I,II, Rdo.) Conjugación y resultados; CrecBact.) Crecimiento bacteriano; OMac) Observación macroscópica: OMicI) Observación por contraste de fases y tinción de Gram; RdoBacProb) Resultados de identificación de la bacteria problema. OMicII) Tinción de esporas; TVirus) Titulación de un virus bacteriófago; API) Ensayos bioquímicos estandarizados. Transduc) Transducción. AnYogur) Análisis microscópico de yogur.

MATERIAL POR PAREJA

A cada pareja se le asignará una clave consistente en el número de la mesa seguido de una letra de la A a la D y dispondrá de una taquilla numerada. En esa taquilla debe de encontrarse el material para prácticas que se indica en el listado, y es responsabilidad de cada pareja comprobar su estado al principio de la práctica y asegurarse de que queda completo una vez concluidas éstas. Diariamente hay que abrir la taquilla con la llave localizada en el tablero junto a las pizarras ( ¡no dejeis las llaves puestas en los candados porque se doblan!).

Equipo:

Un trípode Rejilla para trípode

Un cristalizador Un puente de tinción

Unas pinzas Un asa de siembra

Un rotulador Un Microscopio

Una Propipeta

Colección de colorantes y reactivos.

Cristal violeta Lugol

Safranina Azul de metileno

Verde malaquita Etanol

Frasco lavador con agua Aceite de inmersión.

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MEDIOS DE CULTIVO

Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere disponer de una serie de medios de cultivo estériles. Aunque se darán ya preparados por falta de tiempo, resulta necesario conocer los métodos de preparación y esterilización utilizados habitualmente en el laboratorio.

Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque en su preparación siempre se incluye algún extracto de composición química desconocida. El más utilizado, el caldo común o su versión solidificada con agar, es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias que se van a utilizar en estas prácticas, pero también se emplean otros que contienen inhibidores semiespecíficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas. En algunos casos, se utilizarán medios que contienen componentes tales como indicadores de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una actividad metabólica preferente sobre substratos concretos (Ej: fermentación).

Preparación de medios de cultivo:

Caldo común. Composición por litro.

Extracto de carne 3 g

Peptona bacteriológica 10 g

Cloruro sódico 5 g

Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz de dos litros, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado directamente) y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 5 ml/tubo. El resto del medio se reparte en matraces con 50 y 75 ml. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresión durante 20 minutos.

Agar nutritivo. La composición es

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