ESPECTROFOTOMETRÍA.

La espectrofotometría se refiere a los métodos, cuantitativos, de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Se conocen como métodos espectrofotométricos y según sea la radiación utilizada como espectrofotometría de absorción visible (colorimetría), ultravioleta, infrarroja.

MÉTODOS ESPECTRO ANALITICOS

Un método analítico, depende del sistema químico observado y de la calidad de los instrumentos utilizados para observarlo.

La cantidad de ruido presente en un sistema químico y/o instrumental determina la concentración de analito más pequeña que puede medirse con exactitud, y también fija la precisión de la medida a concentraciones más grandes. Conforme las concentraciones disminuyen hacia el nivel de traza o las fuentes de señales se tornan débiles, el problema de distinguir las señales respecto al ruido se hace cada vez más difícil, ocasionando una disminución en la exactitud y la precisión de las medidas. La capacidad de un sistema instrumental para discriminar entre señales y ruido se expresa, usualmente como la relación señal-ruido:

S/N = amplitud media de la señal / amplitud media del ruido

Varios parámetros permiten caracterizar una medida o un método analítico:

1. El límite de detección mínimo, S, se define como la razón de cambio en la respuesta del instrumento al cambiar el correspondiente estímulo: concentración, temperatura, masa, etc, por ejemplo:

S = dG/dC donde G = Señal de salida, C = Concentración del analito

La sensibilidad de un método analítico, S, se define como la pendiente, m, de la curva de calibración, ya que ésta define la razón de cambio de la propiedad medida por unidad de concentración.

Para los métodos espectrofotométricos, S = mcal = D A/ D C de la curva de calibración Absorbancia vs. Concentración.

La sensibilidad también puede expresarse en términos de concentración como:

S = 0.0044/ mcal relación cuyas unidades corresponden a concentración.

El valor 0.0044 es la absorbancia que corresponde a la mínima diferencia medible con precisión ( D T = 1.0% T ) en instrumentos con escala de % T entre 0.0 y 100.0 ; una absorción de 1% corresponde a 0.0044 unidades de absorbancia, aplicando:

A = log [100 / (100-% absorción) ] = log [100 / ( 100-1)] = 0.00436

Una respuesta no lineal en la gráfica de A vs C indica un cambio en el valor de la sensibilidad en función de la concentración. Conforme la concentración del analito se aproxima a cero, la señal desaparece dentro del ruido y se rebasa el límite de detección.

2- El límite de detección mínimo (LD) ó la concentración mínima detectable es un parámetro estadístico que ha sido muy controvertido. Diferentes autores han dado diversas definiciones y metodologías para su determinación experimental. Actualmente, algunos autores lo definen como la cantidad o concentración mas pequeña del analito que produce una señal XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo Xb. ( Analyst, 1987,112,199-209)

El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea distinguible con certeza (significativamente diferente o estadísticamente diferente) del ruido de fondo es que la diferencia entre la señal del analito, de concentración muy baja, y la señal de los blancos sea igual a tres veces la desviación estandar de la señal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que:

en donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la desviación estándar de las lecturas del blanco.

Experimentalmente, el límite de detección se determina involucrando todos los factores que afectan la medida y se define , en general, para obtenerlo en unidades de concentración como:

LD = 3sb / mcal bajas concentraciones

Donde, sb = desviación estándar de los blancos, mcal es la pendiente de una curva de calibración del sistema, preparada a muy bajas concentraciones. Este criterio es recomendado por IUPAC.

Aplicado a los métodos espectrofotómétricos, entonces, sb = desviación estándar de los blancos en absorbancia y mcal pendiente de la curva de calibración (A vs C) en unidades de Absorbancia/Concentración, por lo tanto, al calcular la relación el límite de detección se obtiene en unidades de concentración.

Otros autores, utilizan para calcular el límite de detección, la siguiente expresión:

En donde C nominal es la concentración del patrón de baja concentración y C promedio corresponde al promedio aritmético, de las concentraciones halladas experimentalmente por interpolación (después de interpolar la absorbancia en una curva de calibración), de por lo menos diez replicas de la solución de baja concentración. Este criterio aunque no lo recomienda IUPAC es muy utilizado en diferentes laboratorios.

3- El límite de detección máximo: Se define como la máxima concentración de un analito que se puede analizar. Generalmente, lo que ocurre, es que las soluciones se hacen tan concentradas, que en el caso de los métodos espectrofotométricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situación equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos soluciones de concentraciones altas. La determinación queda limitada a concentraciones menores del valor de límite de detección máximo, pero en este caso, a diferencia del límite de detección mínimo, el problema se soluciona fácilmente mediante una dilución adecuado. En el caso del límite de detección mínimo, las soluciones son concentrar la muestra o usar otra técnica con límite de detección menor. El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de la curva de Ringbom, como se verá más adelante.

4-Límite de cuantificación: Corresponde a la cantidad o concentración del analito a partir de la cual es confiable realizar determinaciones cuantitativas y se define como:

Límite de cuantificación = LQ = 10s b / m cal bajas concentraciones

5- La precisión de una medida o de un método analítico también se determina por un parámetro estadístico que indique la dispersión de las medidas con relación al valor medio la mediana o la moda de la medida realizada. Generalmente se expresa por la desviación media o desviación estándar. En los métodos espectrofotométricos se determina tanto la precisión del instrumento como la del método en general..

La precisión del instrumento se define entonces por el error instrumental o error fotométrico D T. Experimentalmente se obtiene midiendo la transmitancia de unas 10-20 porciones de una solución

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