EXTRACCION DE ADN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN

PRACTICA 1: EXTRACCION DE ADN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN

GONZÁLEZ AGUIRRE, Karen Michelle; GALLEGO ANGULO, Stiven, Alejandro

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA, FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, PROGRAMA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

UNIVERSIDAD ICESI

SANTIAGO DE CALI, AGOSTO 12 DE 2014

RESULTADOS

El proceso de extracción del ADN geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación. El primer paso en la purificación del ADN consistió en homogeneizar las células y aislar los núcleos de los cuales se extrajo el ADN, por medio del detergente SDS; a continuación se le agregó una solución de NaCl 5M para resuspender el ADN, luego los ácidos nucleicos se precipitaron añadiendo etanol, para finalmente analizar los ácido nucleicos por electroforesis, para la visualización y a través del nanodrop, para medir la concentración de ADN presente en la muestra.

Resultados de electroforesis.

En la figura 1. Se puede alcanzar a observar, la corrida de las muestras en la cámara de electroforesis

Desafortunadamente, no se logró ver lo esperado, una de las razones, puede ser por error instrumental ocasionado por el transiluminador UV. Sin embargo, nos familiarizamos con la técnica de electroforesis en gel de agarosa y conocimos la forma en la que el proceso se lleva a cabo.

En la figura 2. Se puede apreciar, como se visualizan las bandas normalmente en esta técnica.

Resultados del Nanodrop.

Concentración 1025,8 ng/ml

Absorbancia 20,516

Absorbancia 20,146

Contaminación por proteínas

260/280 1,02

Contaminación por polisacáridos

260/230 0,33

ANALISIS DE RESULTADOS.

El ácido desoxiribonucleico (DNA) es la molécula que guarda el código genético de todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.

En el presente laboratorio, se llevó a cabo la extracción de ADN de una muestra de mucosa oral. Para empezar, los ácidos nucleicos se aislaron mediante un tratamiento con el detergente SDS, el cual provocó la ruptura de la membrana celular y la nuclear. El SDS, que significa dodecilsulfato sódico actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. Además, le da un aporte de carga negativa que es sustancialmente mayor que la carga original de la proteína. La repulsión electrostática creada por la unión del SDS a la proteína es una de las causas de que la proteína pierda su conformación nativa1.

Después de centrifugar y haber descartado las células intactas, organelas y restos de membranas, el sobrenadante que contenía los ácido nucleicos solubles, fue tratado con una solución concentrada de NaCl 5M, que permitió separar las proteínas al desnaturalizarlas. El NaCl es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. El ADN que era soluble en la fase acuosa se precipita después de la centrifugación2.

Finalmente, se empleó etanol frio, para que la preparación de DNA tuviera una mayor concentración y pureza. El etanol, cumple la función de limpiar el ADN de otras biomoléculas por un proceso llamado "precipitación". En este proceso, el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean, y lo aísla de la solución acuosa, para dejarlo libre de impurezas. Una vez secado, el ADN, se visualizó, mediante la separación en un gel de agarosa y tinción con un colorante como el SYBR Green. Bajo luz ultravioleta, estas moléculas se pudieron observar con un color producto de la capacidad de fluorescencia del colorante.

La electroforesis es una de las técnicas mas empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación. Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo

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