Espectrofotometro

ESPECTROFOTÓMETRO

La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro, construido mediante procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia.

PROPÓSITO DEL EQUIPO

El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.

PRINCIPIOS DE OPERACIÓN

Como principio básico se considera que la luz es una forma de energía electromagnética, que en el vacío tiene una velocidad constante [C] y universal de aproximadamente 3 x 108 m/s. En cualquier otro medio (transparente) por el que pase la luz, su velocidad será ligeramente inferior y podrá calcularse mediante

donde:

v= velocidad a través del medio por el que pasa la luz

n= índice de refracción del medio, cuyo valor oscila, por lo general, entre 1,0y 2,5

La energía electromagnética dispone de una muy amplia gama de longitudes de onda. Al-gunos ejemplos se muestran en la siguiente tabla1:

La luz, al pasar o interactuar con diversos medios, presenta una serie de fenómenos, entre los que destacan la reflexión, refracción, difracción, absorción, difusión, polarización y otros que son utilizados en diversos instrumentos y dispositivos. La siguiente tabla muestra los rangos de longitud de onda en donde se utiliza el espectro luminoso para realizar pruebas de espectrofotometría.

Con respecto a la interacción de la luz con la materia, el siguiente esquema ayuda a enten-

der la complejidad de los fenómenos que ocurren:

El esquema muestra que la radiación incidente [Io] sufre una serie de transformaciones. Parte de la misma se refleja [Ir], parte se transmite [It], parte se difunde [Id] y parte se absorbe e incide directamente en fenómenos como la fluorescencia [If]. Los fenómenos en los que se basa la espectrofotometría son principalmente la absorción y la transmisión. Para entender cómo se utilizan, es necesario adicionalmente tener encuenta la ley de Beer Lambert.11

La absorbancia [A] se relaciona con la transmitancia [T] mediante la siguiente ecuación:

Ley de Beer Lambert. Se conoce también como ley de Beer o de Beer Lambert Bouguer e identifica la relación existente entre la concentración de la muestra y la intensidad de la luz transmitida a través de la misma. Con relación a la ley en mención hay implícitos dos conceptos: transmitancia [T] y absorbancia [A].

La transmitancia [T] es la fracción de la luz incidente que a una determinada longitud de onda pasa a través de la muestra. Se define por la siguiente relación:

donde:

It = intensidad de la radiación transmitida

Io = intensidad de la radiación incidente

El porcentaje de transmitancia [%T] puede expresarse por la siguiente ecuación:

La concentración de moléculas absorbentes de luz en la muestra es proporcional a la absorbancia [A] de la muestra. Matemáticamente se expresa así:

donde:

A=absorbancia medida

ε =coeficiente de absortividad molar [litros/moles/cm]

l =distancia de la trayectoria recorrida por la luz dentro de la muestra

c=concentración de la muestra [moles/litros]

La absorbancia [A] se relaciona con la transmitancia [T] mediante la siguiente ecuación:

Las curvas que se presentan a continuación muestran cómo varía la absorbancia [A] y la transmitancia [T] en función de la concentración [C], de acuerdo con la ley de Beer Lambert, en la que se basa la espectrofotometría2.

Como conclusión puede inferirse que, a medida que aumenta la concentración de una sustancia, la transmitancia disminuye y que, al aumentar la concentración de la sustancia, aumenta la absorbancia.

La linealidad de la Ley de Beer Lambert se ve afectada, si se presentan las siguientes condiciones:

1. Corrimientos en equilibrio químico de la muestra como una función de la concentración.

2. Desviaciones de los coeficientes de absorvidad, concentraciones mayores de 0,01M debido a la interacción electrostática entre moléculas cercanas.

3. Cambios en el índice de refracción de altas concentraciones del analito

4. Difusión de la luz debido a partículas en la muestra.

5. Fluorescencia fotofosforescencia de la muestra.

6. Radiación no monocromática.

Componentes del espectrofotómetro

El esquema que se presenta a continuación describe la interrelacion de los diversos componentes de un espectrofotómetro. Los más importantes son los siguientes:

1. La fuente luminosa.

2. El monocromador.

3. El portador de muetras.

4. El sistema detector.

5. El sistema de lectura.

Fuente luminosa

Dependiendo del tipo de espectrofotometría, la fuente luminosa puede ser una lámpara con fi- lamento de tungsteno para luz visible, o una lámpara de arco de deuterio para luz ultravioleta. Algunos fabricantes han diseñado espectro fotómetros con lámparas intermitentes de xenón de alta duración que emiten luz en el rango de la luz visible y ultravioleta. La lámpara o lámparas vienen montadas de fábrica en una base que permite asegurar una determinada posición, para que se mantengan las condiciones de ajuste óptico y enfoque cuando está en operación o se requiere reemplazarla. La energía radiante típica que emite una lámpara de tungsteno está entre los 2 600 y los 3 000 °K (grados Kelvin).

Monocromador

Está compuesto por un conjunto de elementos. En general, dispone de una rendija o ranura de entrada que limita la radiación lumínica producida por la fuente y la confina en un área determinada, un conjunto de espejos para pasarla luz a través del sistema óptico, un elemento para separar las longitudes de onda de la radiación lumínica, que puede ser un prisma o una rejilla de difracción, y una rendija de salida para seleccionar la longitud de onda con la cual se desea iluminar la muestra. Las rejillas de difracción tienen la ventaja de eliminar la dispersión no lineal y son insensibles a los cambios de temperatura.

Portador de muestras

Está diseñado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de luz de longitud de onda determinada por el monocromador. El elemento que contiene la muestra es una celda o cubeta, por lo general, rectangular. Las celdas o cubetas se fabrican de vidrio, si se requie-ren efectuar estudios en el rango de los 340 a los1 000 nm y de sílice, si el análisis está en el rango comprendido entre los 220 y los 340 nm. También hay celdas en materiales plásticos como estireno o poliestireno. El portador de muestras lo diseñan los fabricantes de acuerdo al tipo de es-pectrofotómetro y de muestra a analizar, por ello se encuentran portadores de muestra con microceldas, aunque también tubos de ensayo y otras variantes como las celdas de flujo continúo.

Sistema detector

El sistema de detección puede estar diseñado con foto celdas, fototubos, fotodiodos o foto-

multiplicadores. Esto depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de la velocidad de respuesta requeridas. El sistema de detección recibe la energía lumínica proveniente de la muestra y la convierte en una señal eléctrica proporcional a la energía recibida. La señal eléctrica puede ser procesada y amplificada, para que pueda interpretarse a través del sistema de lectura. En la tabla que se incluye a continuación, se presenta un resumen de las ventajas y desventajas de los dispositivos normalmente usados en los sistemas de detección.

Sistema de lectura

La señal que sale del detector recibe diversas transformaciones. Se amplifica y se transforma para que su intensidad resulte proporcional al porcentaje de transmitancia/absorbancia. Existen sistemas de lectura de tipo análogo (muestra la magnitud leída sobre una escala de lectura) o digital (muestra la magnitud leída en una pantalla). Los indicadores de tipo análogo reciben tradicionalmente el nombre de metros. Su exactitud depende, entre otros factores, de la longitud de la escala y del número de divisiones que tenga.(Mientras más divisiones, más exacto). Su principal desventaja es que pueden ser mal leídos, por la fatiga de los operadores o errores, cuando dis-ponen de varias escalas, al tratar de identificarlas escalas sobre las que deben realizar la lectura. Los indicadores digitales usualmente presentan los resultados en una pantalla, en forma de caracteres alfanuméricos luminosos. Esto los hace menos propensos a que se cometan errores de lectura.

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