Evaluacion De Genotoxicidad Prueba Comegta

Evaluación de la actividad genotóxica del maleico hidrazida, etil metano sulfonato, y dietilamina N-nitroso en Tradescantia

Técnicas que permiten la detección de daños en el ADN son excelentes herramientas en la carcinogénesis y ambiental toxicología estudios1 - 3 Uno de los métodos más ampliamente utilizado para detectar la actividad genotóxica de química o agentes físicos es la prueba de mutación somática en Tradescantia pelos estaminales ( clon 4430 ) 0.4 Esta prueba se basa en el hecho de que las células estaminales de pelo Tradescantia son heterocigotos por color (Aa ) . El alelo dominante cuentas (A) por el color azul y el alelo recesivo ( a) es responsable del color rosado. Las mutaciones en el dominante alelo dará como resultado que expresa el alelo recesivo (células rosa) .5,6 Este sistema muestra una alta precisión en experimentos de laboratorio, y se aplica también en el seguimiento in situ en el medio ambiente . Se requiere sólo capacitación a corto x 2 El protocolo de Tradescantia incluye la recogida de datos a lo largo de un período de 9 días , generalmente días 7 a 15 después tratamiento.5 , 6 La frecuencia de mutación rosa en los pelos estambre se expresa como el número de los eventos mutantes , ya sea por el pelo (por lo general 103 pelos ) o por división de las células del cabello ( por lo general 104 división de células de cabello ) 0,4 Una de las pruebas más recientes de detección genética daños en las células es el ensayo cometa alcalino . permite la cuantificación de bajos niveles de daño del ADN en individuo células , es muy sencillo y sólo requiere sólo una pocos cells.7 , 8 Esta técnica detecta la rotura de hilos , álcali lugares sensibles , y la unión . Ha sido ampliamente utilizado en las células animales como well.7 - 10 El sistema de ensayo cometa ha demostrado ser más sensible que otros ensayos en la detección de mutagenicity.11 En las células vegetales , la única célula ensayo de electroforesis en gel es menos frecuente , sin embargo , una número de estudios se han reportado en la inducción de las mutaciones de química mutagens.12 - 20 Koppen y Verschaeve informó de la primera aplicación de la ensayo cometa a las células vegetales para la evaluación genotoxicológico, en núcleos de Vicia faba . El análisis de genómica También se estudió el daño inducido por el ccsme cells.14 tabaco cultivado, 16 Poli et al, 19 aplica la ensayo cometa a los leucocitos humanos y, con importantes mejoras , a las células vegetales (raíces Allium cepa y epígeos tejidos de Impatiens balsamina ) . Los primeros hallazgos en los leucocitos humanos confirmado la sensibilidad de este ensayo , su peculiaridad , y su aplicabilidad en la evaluación genotoxicidad en muestras ambientales . Los núcleos de Células de la raíz de Vicia faba se utilizaron para la capacidad de reparación valor al daño del ADN inducido por rayos X medido por el cometa assay.15 Todos los sistemas , que informan el uso de la prueba del cometa en los núcleos de las plantas, se refiere que es necesario para romper las paredes celulares y el uso de un gradiente de centrifugación a separar los núcleos . Tradescantia células ciliadas estaminales y sus núcleos están muy grande y muy fácil de obtener. En estas células , la ensayo de cometa se puede utilizar sin la inmersión del tejido en nitrógeno líquido o centrifugación en una densidad gradiente para separar los núcleos . El presente trabajo se llevó a cabo para lograr dos objetivos principales: estandarizar el ensayo cometa en Tradescantia núcleos y utilizarlo para la monitorización ambiental genotoxics , y compararla con la Tradescantia sistema de cabello staminal .

Material y Métodos

Mutágenos químicos y dosis utilizadas en este experimento fueron: dietilamina N -nitroso ( NDEA ) 1 , 5 , y 10 mM ; hidrazida maleica ( MH ) 1 , 5 , y 10 mM ; y etil metano sulfonato (EMS ) 15 , 30 y 45 mM ( Sigma Chemical Co , EE.UU.) . Plantas Tradescantia , (clon 4430 ) (híbrido T. subacaulis X T. hirsutiflora ) es altamente sensible a los mutágenos ambientales ; que fue proporcionado por el Laboratorio de Citogenética y Mutagénesis del Centro de Ciencias de la Atmósfera de la

Universidad Nacional Autónoma de México. Para aumentar la eficiencia de la puntuación, la mutación de color rosa tasa se calculó sobre la base del número de eventos mutantes rosa, dividido por el número medio de los pelos por flor , y se expresa en términos de color rosa eventos mutantes por 1 000 pelos . Tratamiento y Scoring en Tradescantia Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones controladas , con una temperatura durante el día 22 ° C y un 16-18 ° C durante la noche temperatura . Para cada tratamiento fueron 30 inflorescencias sumergido durante 3 h en 250 ml de la solución a analizar . Después del tratamiento, los cortes se lavaron a fondo en grifo de agua durante 30 minutos y se coloca en un vaso de precipitados con Hoagland de solución de nutrientes . Plantas no tratadas sumergidos en solución de Hoagland se utilizaron como controles negativos . Para cada tratamiento , 5-10 flores ( es decir, aproximadamente 1 a 500 3 pelos 000 estambre ) fueron anotados todos los días , en función sobre cómo se disponía de muchas flores. Se observaron los pelos estaminales diariamente desde el día 7 a 15 días después de la aplicación de productos químicos , período que la mutación de color rosa es evidente. El mutacional eventos, así como el número de pelos observados y los Las células se marcaron con un microscopio de disección. La frecuencia de las células de color rosa ( eventos por 1 000 células ) se estableció de acuerdo con la metodología descrita por Underbrink et al5 Los valores medios de color rosa

mutación se muestran con intervalos de confianza del 95 % ( p = 0,05 ) . La obtención de los núcleos Estaminales núcleos de las células de pelo se separaron de la siguiente manera : Veinticuatro estambres de las plantas se trataron como se describe arriba (esto fue necesario comparar las dos pruebas ) y obtenido día 14 después del tratamiento se colocaron en un frío mortero y 440 ml de tampón de Honda ( 0,44 M de sacarosa , 2,5 % de Ficoll ( tipo 400 ) , 5 % de dextrano T - 40 , 25 mM Tris- HCl (pH 8,5 ) , MgCl2 10 mM , 10 mM de b - mercaptoetanol , y se añadieron 2,5 % Triton X -100) . Según el ensayo de mutación rosa, en este período de la mutación más alta frecuencia se produce . Después de la homogeneización , la mezcla se filtró a través de una tela de nylon , ( malla 80 micras ) . la núcleos se separaron por centrifugación a 3000 rpm ( 4 ° C ) durante 3 minutos . Un gradiente de centrifugación y se congelación en nitrógeno líquido para romper la pared celular no eran necesarias para núcleos separados . Esta sección es diferente del método utilizado por Koppen y Verschaeve y representa una

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